欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）两种微创性别鉴定方法的评估

《Journal of Fish Biology》：Assessment of two minimally invasive methodologies for sex identification in the European eel, Anguilla anguilla

　　

摘要：性别是行为、生态和生理变异的重要驱动因素。目前，对极度濒危的欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）进行性别鉴定需要牺牲鱼类，或利用体长等形态学差异，但后者在某些栖息地及中间体长范围内可能不准确。因此，该物种需要用于准确性别鉴定的非致死性工具。在此，研究人员测试了两种微创性别鉴定方法的有效性：（1）超声检查法和（2）取自胸鳍鳍条的分子标记法。两种方法均应用于河流型欧洲银色鳗鲡，并与组织学性别鉴定结果进行比较。超声检查能准确识别雌性鳗鲡的性腺，而雄性则通过未检测到可辨识的性腺结构来判定。研究人员评估了先前用于日本鳗鲡（Anguilla japonica）性别鉴定的三个分子标记（dcn、LOC111853410、kera）的表达水平。这三个分子标记在性别间无显著差异表达，表明这些标记不能准确用于欧洲鳗鲡的性别鉴定。研究结果表明，使用超声检查的微创成像技术可成为鉴定早期成体洄游欧洲鳗鲡性别的可靠工具，尤其适用于中间体长（400–500 mm）以及因洄游潜力受限而可能经常超过典型生长尺寸的栖息地中的个体。该技术对于解决这一极度濒危物种的生态学、行为学、保护和管理问题具有重要价值。

**论文解读：欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）两种微创性别鉴定方法的评估**

**一、研究背景与问题**

性别是驱动动物行为、生态和生理变异的重要因素。在鱼类中，性别特异性差异可能影响个体对人为干扰的生理和行为响应，例如污染物在性别间的累积差异及其神经毒性效应，以及捕捞和气候变化对种群性别比例的潜在影响。因此，准确的性别鉴定是鱼类管理和保护的关键环节，也是理解生态学、进化生物学和行为学的基础。

欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）被国际自然保护联盟（IUCN）列为极度濒危物种。该物种的性别由环境决定而非遗传决定，缺乏性染色体，因此无法通过常规的遗传检测方法鉴定性别。目前，欧洲鳗鲡的性别鉴定主要依赖牺牲鱼类进行性腺组织学检查，或利用体长差异进行推测（总长超过500 mm判定为雌性，低于460 mm判定为雄性）。然而，形态学方法在400–500 mm的中间体长范围内准确性不可靠，且在洄游受限的湖泊或水库等系统中，个体可超过典型生长尺寸，使体长标准失效。此外，欧洲鳗鲡银色期个体缺乏明显的第二性征，眼径和胸鳍形状等形态差异也受遗传、年龄和环境因素影响，无法可靠区分性别。因此，亟需开发非致死、微创且准确的性别鉴定工具，以满足保护管理、生态研究和圈养繁殖等需求。

**二、研究目标与技术方法**

本研究旨在评估两种微创性别鉴定方法的有效性：（1）超声检查法，使用标准便携式设备（GE Versana Active）和手持无线设备（GE VScan Air）；（2）分子标记法，检测先前在日本鳗鲡中成功用于性别鉴定的三个基因（dcn、LOC111853410、kera）在胸鳍组织中的表达水平。

研究样本采集自英国林肯郡南部黑文河（River Haven），由商业鳗鱼渔民捕获47尾银色欧洲鳗鲡。样本经安乐死后，采集全长、体重、眼部指数和鳍指数等形态学数据。超声检查采用三种协议：全面协议（6尾）、全身协议（20尾）和快速协议（21尾），检查结果与组织学性别鉴定结果进行比较。组织学检查由经认证的病理学家对性腺切片进行H&E染色后确定性别。分子标记分析按照Hsu等人（2023）的方法，从胸鳍组织提取总RNA，经逆转录和实时荧光定量PCR（qPCR）检测三个目标基因的表达水平，以酸性核糖体磷蛋白P0（arp）作为管家基因，采用2^-ΔΔCT法计算相对表达量。统计分析使用Cohen's kappa评估超声检查与组织学结果的一致性，并使用t检验比较基因表达的性别差异。

**三、主要研究结果**

**3.1 解剖与组织学检查**

解剖检查显示，雌性性腺呈叶状白色组织，沿泳膀胱两侧延伸至腹侧体腔，横截面直径约10–20 mm；雄性性腺则呈直径小于1 mm的平滑白色纤维状。组织学检查成功鉴定了91%（43/47）个体的性别，其中49%（n=23）为雌性，42%（n=20）为雄性，9%（n=4）样本组织不足无法判定。所有体长小于460 mm的个体均为雄性（n=16），所有体长大于500 mm的个体均为雌性（n=21）。在400–500 mm范围内有6尾个体，其中2尾为雌性，4尾为雄性。

**3.2 眼部指数与鳍指数**

眼部指数范围为3.92–10.44（均值6.78±1.24 SD），其中59.6%（28/47）个体眼部指数大于6.5，被归类为性成熟成体。雌性中96%（22/23）鳍指数大于4.3，雄性中75%（15/20）鳍指数大于4.7，表明大部分个体处于银色鳗鲡洄游阶段。

**3.3 分子标记评估**

对13尾个体的初步分析显示，三个基因（dcn、LOC111853410、kera）的相对表达量在性别间均存在重叠，且无显著差异（dcn：p=0.08；LOC111853410：p=0.19；kera：p=0.33）。这表明这三个在日本鳗鲡中具有性别差异表达的基因不能可靠用于欧洲鳗鲡的性别鉴定，因此未对剩余样本进行进一步分析。RNA完整性指数（RIN）介于7.2–8.9之间。

**3.4 超声检查**

超声检查成功对全部47尾个体进行了性别判定。在具有组织学确认的43尾个体中，使用Versana设备扫描的23尾个体全部与组织学结果一致（100%），使用VScan Air设备扫描的43尾个体中有42尾一致（98%）。Cohen's kappa值介于0.88–1.00之间，表明超声检查与组织学鉴定结果具有高度一致性。在7尾体长介于400–500 mm的个体中，6尾具有组织学确认结果，超声检查准确率为100%。雌性性腺在超声图像中表现为相对于肝脏组织的低回声结构，可通过多个扫描窗口连续追踪至肛门孔；雄性则通过无法观察到性腺结构来判定。

**四、讨论与结论**

本研究表明，超声检查可准确鉴定河流型银色欧洲鳗鲡的性别，准确率介于98%–100%，且无需牺牲鱼类或进行激素诱导成熟。相比传统的组织学检查（本研究中准确率仅91%），超声检查具有更高的成功率和非致死性优势。便携式手持超声设备（VScan Air）适用于野外环境，为生态学研究和保护管理提供了实用工具。超声检查在400–500 mm中间体长范围内具有100%的准确性，优于基于体长的形态学判定方法，尤其适用于洄游受限水域中体型异常增大的个体。

分子标记法在欧洲鳗鲡中未能成功复现日本鳗鲡的研究结果，表明性别偏倚基因在两种近缘鳗鲡物种间可能未保守。种间基因表达差异可能源于物种分化或样本成熟度差异，但本研究与Hsu等人（2023）的眼部指数和鳍指数相近，提示成熟阶段可能并非主要影响因素。未来研究应通过全转录组分析等方法，从欧洲鳗鲡胸鳍组织中筛选候选性别二态性基因，或探索表观遗传学、microRNA和血浆性激素等替代方法。

本研究首次在河流型早期洄游阶段欧洲鳗鲡中验证了超声检查的可靠性，为这一极度濒危物种的保护管理提供了重要的非致死性工具。该技术可应用于研究性别决定机制、性别间栖息地利用差异、人为压力对性别比例的影响等关键问题，对制定有效的保护和管理策略具有重要意义。论文发表在《Journal of Fish Biology》。