利用光谱相位分析技术进行高光谱成像，以阐明细胞中吖啶橙的光物理性质

《Microscopy Research and Technique》：Spectral Phasor Analysis for Hyperspectral Imaging to Elucidate Acridine Orange Photophysics in Cells

阿昔洛蓝（AO）通过荧光光谱分析揭示其与核酸的相互作用机制，光谱相干分析（SP）有效区分AO-DNA、AO-RNA及640nm新组分，定量解析酸性胞质中RNA富集区室，突破传统模型限制，为活细胞成像提供新方法。

　　

摘要

吖啶橙（AO）具有复杂的光物理特性，这些特性已被用于研究其与RNA和DNA的相互作用。传统上，AO被用于染色细胞，根据DNA和RNA成分的差异来区分细胞核和细胞质。其标记行为会因浓度和pH值等因素而变化。AO的荧光信号丰富且复杂，因此获取完整的光谱或荧光寿命数据有助于理解其复杂的光物理现象。然而，处理4D数据集可能具有挑战性，通常需要依赖复杂或参数化程度较高的模型进行分析。无模型方法，如用于高光谱成像（HSI）的光谱相位（SP）分析，非常适合应对这些分析难题。利用SP分析的线性组合和互易性原理，我们在体外实验中识别出了RNA和DNA的光谱特征，这些特征在活细胞和固定细胞中都保持一致。有趣的是，对活细胞中AO荧光的SP分析揭示了640纳米处的第三个光谱成分。SP分析的线性特性使得能够量化与RNA、DNA以及第三个成分结合的AO。使用AO和LysoTracker进行共标记表明，其中一些亚细胞结构与酸性区室相关。此外，SP分析还能区分AO在细胞质区室中的自相互作用与其与RNA的结合。本研究确立了SP分析作为AO高光谱成像的强大工具，从而加深了我们对AO复杂光物理现象的理解，并为先进的活细胞成像应用开辟了新的可能性。

亮点

• 高光谱成像的光谱相位分析能够区分细胞中的三种不同的吖啶橙（AO）分子状态：AO–DNA、AO–RNA以及与640纳米发射相关的第三个活细胞成分。
• 体外实验和活细胞实验中AO–DNA和AO–RNA的光谱特征保持不变，从而实现了无需模型的核酸相互作用识别。
• 第三个AO成分对应于富含RNA的酸性细胞质结构，澄清了长期以来关于活细胞中AO光物理现象的争议。
• SP分析方法能够进行定量的像素级组分分析，揭示了异质性的AO–RNA/DNA分布，并揭示了细胞间的差异。
• 该工作流程展示了将HSI与光谱相位分析相结合在解码复杂光物理现象以及提高常用荧光染料在细胞生物学中可解释性方面的强大作用。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可在以下doi地址公开获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.15500562。