甲基取代卤代及甲氧基环己六醇的碳酸酐酶抑制、抗氧化特性与选择性抗癌活性研究

《BioMed Research International》：Investigation of Carbonic Anhydrase Inhibition, Antioxidant Properties, and Selective Anticancer Activity of Methyl-Substituted Halogenated and Methoxy Conduritols

本研究探讨了十种甲基取代卤代及甲氧基环己六醇衍生物的生物活性。实验表明，这些化合物（特别是化合物6）对碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA）异构酶hCA I和hCA II显示出强效抑制，其Ki值显著优于标准抑制剂乙酰唑胺（AZA）。同时，多数化合物表现出良好的抗氧化能力（如TAS、DPPH、FRAP法评估），其中化合物10的总抗氧化能力甚至超越维生素E。尤为重要的是，化合物6对MCF-7乳腺癌细胞系展现出选择性细胞毒性（IC50为20.22 ± 1.97 μM），而对健康L929成纤维细胞影响较小。分子对接研究进一步证实了这些化合物与hCA I/II及乳腺癌蛋白（1JNX, 1A52）具有较强的结合亲和力。ADME/T分析预测其药代动力学性质良好。综合来看，这些甲基取代环己六醇衍生物作为多功能的生物活性分子，在开发治疗癫痫、青光眼及乳腺癌的潜在非磺胺类CA抑制剂（CAIs）方面展现出巨大前景。

　　

1. 引言

环己六醇（Conduritols）是与碳环糖（carbasugars）结构类似的化合物，在多种生物过程中具有应用前景。其苯并、甲基及卤代衍生物同样受到研究者关注，已知部分衍生物具有拒食、抗菌、抗白血病及生长调节活性。另一方面，含有甲氧基和卤素官能团的Pericosins和Gabosins属于碳环糖类，是重要的生物活性化合物。

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA; carbonate hydrolyase, EC 4.2.1.1）是一种含锌金属酶，在多种组织中发挥功能。它能可逆地催化二氧化碳水合为碳酸氢盐。目前多数CA抑制剂（CAIs）属于磺胺类衍生物，但存在缺乏同工酶特异性导致的脱靶抑制及副作用问题，且约3%–6%的人群对磺胺类药物过敏。因此，开发非经典的、同工酶特异性的CAIs具有重要意义。尤其在神经系统，hCA参与调节细胞内外pH值缓冲，其抑制具有抗惊厥活性，为开发新型抗癫痫药物提供了靶点。

乳腺癌的发病率不断上升，现有抗癌药物常因毒性而损伤健康组织。因此，针对乳腺癌（如常用细胞系MCF-7，代表预后较好的管腔A型肿瘤）开发具有靶向性、副作用更小的新型抑制剂是当前的研究热点。

环己六醇本身是具有重要生物活性的分子，是许多天然产物的结构单元，其结构中常含多个羟基官能团，存在于多种药理药物中。对其结构进行甲基化、卤化等修饰是药物化学领域的研究焦点。本研究旨在探究10种此前已合成并表征的甲基取代卤代和甲氧基环己六醇的抗癌潜力、潜在抗癫痫活性及抗氧化能力。

2. 材料与方法

2.1. 化学合成

研究从甲基取代的对苯醌出发，经溴化、硼氢化钠还原羰基得到烯丙基反式二醇2。化合物2与甲醇钠/甲醇体系反应，并经Ac₂O/吡啶系统处理后，得到二甲氧基-二乙酰氧基环己六醇B衍生物4（产率89%）。由化合物2乙酰化得到5，再经AcOK和Ac₂O在乙酸中处理得到芳香族化合物6（高产率）。

以LiOH为碱，从二溴化物5经区域选择性反应制备环氧化物7。通过两步法，从环氧化物得到环己六醇A衍生物的溴代三乙酸酯9。用NaOMe/甲醇脱去化合物9中的乙酰基，几乎定量（产率93%）地得到了预期的甲基取代甲氧基环己六醇10。相比之下，环氧化物7与AcCl发生区域和立体选择性开环反应，形成了二卤-二乙酸酯化合物11（产率56%），其构型为环己六醇A型。

2.2. 酶学研究

采用基于CA酯酶活性的方法评估化合物对两种生理相关CA同工酶（hCA I和hCA II）的抑制潜力，以4-硝基苯乙酸酯为底物，通过监测348 nm波长下的吸光度变化来测定酶活。

2.3. 抗氧化活性

采用多种方法评估化合物的抗氧化能力：

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  总抗氧化状态（TAS）：使用商业试剂盒测定，结果以Trolox当量表示。
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  DPPH自由基清除法：测定化合物清除稳定的DPPH自由基的能力。
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  铁离子还原抗氧化能力（FRAP）法：基于抗氧化剂将Fe³⁺-TPTZ复合物还原为蓝色的Fe²⁺-TPTZ，测定其593 nm下的吸光度。

2.4. 抗癌效应

采用MTT法评估化合物2–11对MCF-7人乳腺癌细胞系的抗癌活性，并以L929健康小鼠成纤维细胞作为对照评估选择性。计算IC₅₀值。对于活性显著的化合物6，进一步通过膜联蛋白V（Annexin V）结合实验和细胞周期分析（使用MUSE流式细胞仪）研究其诱导凋亡和细胞周期阻滞的作用机制。

2.5. 理论计算

利用薛定谔Maestro分子建模平台进行分子对接研究，评估化合物与目标蛋白（hCA I：PDB ID 3LXE；hCA II：PDB ID 5AML；乳腺癌蛋白：PDB ID 1JNX和1A52）的相互作用。通过Qik-prop模块进行ADME/T（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）分析，预测化合物在人体内的代谢行为。

3. 结果

3.1. CA抑制活性结果

所有合成的甲基取代单/二甲氧基环己六醇衍生物均显示出对hCA I和hCA II的强效抑制。抑制数据汇总于表1中。其中，化合物6对hCA I的抑制最强（IC₅₀= 0.407 μM），而化合物5对hCA II的抑制最强（IC₅₀= 0.331 μM）。所有化合物的Ki值范围在0.0857 ± 0.06 至 2.2098 ± 0.68 μM之间，均显著优于阳性对照药乙酰唑胺（AZA，对hCA I和II的IC₅₀分别为18.110 μM和20.650 μM）。IC₅₀和Ki值的变化趋势如图4、图5和图6所示。这些结果表明，这些化合物可能代表了一类有别于经典磺胺骨架的新型CAIs，与之前报道的酚类和香豆素类非经典CAIs作用模式类似。

3.2. 抗氧化活性

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  TAS：化合物10的总抗氧化能力最高（1.256 ± 0.086 mmol Trolox Equiv./L），甚至超过了维生素E（1.000 ± 0.097）。化合物2和6也显示出较高的抗氧化能力。
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  DPPH：化合物2、6和10的DPPH自由基清除能力（IC₅₀值分别为213.71、183.20和174.56 μM）强于抗坏血酸标准品（227.08 μM）。
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  FRAP：化合物2和10的铁离子还原能力（IC₅₀值分别为0.481和0.325 μM）强于维生素E（0.629 μM）。

3.3. 抗癌效应

MTT实验结果显示，在测试的化合物中，只有化合物6对MCF-7细胞表现出显著的抗癌活性，其IC₅₀为20.22 ± 1.97 μM，且对正常L929细胞的毒性较低（IC₅₀为88.77 ± 0.71 μM），显示出一定的选择性。其他化合物在测试浓度下基本无活性。100 μM浓度下各化合物对MCF-7和L929细胞活力的影响如图7所示。

流式细胞术分析显示，在IC₅₀剂量下，化合物6处理24小时后，MCF-7细胞中活细胞比例降至71.42%，而27.63%的细胞进入凋亡阶段；在L929细胞中，活细胞比例高达97.32%，凋亡细胞仅为2.55%。细胞周期分析表明，化合物6导致了MCF-7细胞在G0/G1期显著积累（达88.8%），而在健康细胞中未引起明显的细胞周期紊乱。

3.4. 理论计算

分子对接研究阐明了活性分子与靶蛋白的相互作用模式。例如，化合物6与hCA I酶、化合物7与hCA II酶、以及化合物6与两种乳腺癌蛋白（1A52和1JNX）的相互作用分别如图9、图10、图11和图12所示。对接计算产生的各项参数（如对接分数、Glide ligand efficiency、氢键、范德华能和库仑能等）汇总于表6中，为分析化合物的结合亲和力和相互作用提供了量化依据。ADME/T分析预测这些化合物具有良好的药代动力学特性，具备成为候选药物的潜力。

4. 结论

本研究综合评估了十种甲基取代卤代及甲氧基环己六醇衍生物的多种生物活性。实验结果表明，这些化合物是高效的碳酸酐酶抑制剂，其抑制效力远超标准药物乙酰唑胺，在治疗癫痫和青光眼方面具有潜力。同时，它们展现出显著的抗氧化能力，部分化合物的活性超越了维生素C和维生素E。尤为重要的是，化合物6对MCF-7乳腺癌细胞表现出选择性细胞毒性，并能诱导癌细胞凋亡和G0/G1期细胞周期阻滞，显示了其作为抗癌先导化合物的价值。分子对接研究从理论上支持了这些化合物的高活性，ADME/T分析则预示了良好的成药性。综上所述，这类甲基取代环己六醇衍生物作为多功能生物活性分子，在开发治疗神经系统疾病、眼部疾病及癌症的新型药物方面展现出广阔的应用前景，值得进行更深入的临床前研究。