基于计算方法设计的Laccase-COOH-SWCNT/SPCE电化学生物传感器，用于选择性检测酪胺

《Microchemical Journal》：Computation-guided design of a Laccase-COOH-SWCNT/SPCE electrochemical biosensor for selective tyramine detection

酪胺生物传感器开发：基于分子模拟指导的漆酶-碳纳米管复合电极设计，通过分子对接、动力学模拟和MM/PBSA分析揭示酪胺与漆酶T1铜中心的结合机制，构建的传感器检测限7.75×10?? M，灵敏度高，对复杂基质有良好选择性。

　　

Nurul Hana Mas'od|Mohammad Nazri Abdul Bahari|Syaza Azhari|Mohamad Arif Mohamad Jamali|Nadrahtul Huda Misral|Amir Syahir Amir Hamzah

马来西亚伊斯兰科学大学科学技术学院，71800 Nilai，Negeri Sembilan，Darul Khusus，马来西亚

摘要

酪胺（TYM）是肉制品中主要的腐败生物标志物，因此需要快速且具有选择性的现场检测技术。本研究提出了一种计算引导策略，结合了分子对接、分子动力学（MD）和分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）自由能分析，并结合实验生物传感器的制备，以合理化并增强漆酶（LAC）对TYM的识别能力。对接和MD模拟显示，TYM结合在靠近T1铜位点的疏水口袋内，该结合通过Ala80的氢键固定，并由Phe344、Pro346、Leu112和Leu459稳定。LAC-TYM复合物在100纳秒内保持结构稳定，MM/PBSA计算得到的结合自由能（ΔG_bind ≈ ?22.6 kcal/mol）主要由范德华力驱动。基于这些原子级见解，构建了一种LAC–COOH-SWCNT/SPCE生物传感器，并通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）和原子力显微镜（AFM）进行了表征，确认了酶的均匀固定。差分脉冲伏安法（DPV）的检测范围为2.58 × 10^?5至1.92 × 10^?4 M，检测限（LOD）为7.75 × 10^?6 M，定量限（LOQ）为2.58 × 10^?6 M，灵敏度为0.0136 μA mM^?1，相关系数（R^2 = 0.984）。该传感器表现出很强的选择性，对结构无关的生物胺几乎没有干扰，在添加了TYM的鸡肉样品中回收率良好（78.2–105.8%）。这项工作为生物传感器工程建立了一个从计算到实验的统一框架，并强调了原子级建模在指导酶-纳米材料界面设计以应用于食品安全方面的潜力。

引言

生物胺是通过氨基酸的酶促脱羧作用产生的低分子量有机化合物，它们通常在富含蛋白质和发酵的食物中积累，如肉类、奶酪和海鲜[1]、[2]。在这些化合物中，酪胺（TYM）尤为重要，因为它与微生物腐败有很强的关联，并且是新鲜度的重要指标[3]、[4]。酪胺水平的升高不仅反映了食物的降解，还带来了健康风险，包括高血压、偏头痛和食物中毒[5]。因此，快速可靠的酪胺检测对于有效的食品质量监测至关重要。尽管高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和质谱（MS）等色谱技术具有较高的分析性能，但由于它们依赖于耗时的样品制备、较长的分析时间和专用仪器，限制了其在常规筛查和现场应用中的适用性[6]。电化学生物传感器因其便携性、快速响应和成本效益而成为一种有吸引力的替代方案，特别是当与酶识别元件结合使用时[7]。

为了更好地理解酪胺在分子水平上的识别机制，进行了分子对接实验，以预测酪胺在漆酶（LAC）活性位点内的结合方向和相互作用特征。对接模拟表明，酪胺结合在靠近酶表面的T1铜位点，并与几个关键残基相互作用，包括Ala80、Phe81、His111、Leu112、Ser113、Phe344、Pro346、Phe450、Leu459和Glu460。这些计算结果提供了关于底物特异性的结构见解，并支持基于酶的生物传感器的合理设计[8]。在此基础上，进行了分子动力学（MD）模拟，以研究LAC-TYM复合物的构象稳定性和动态行为。MD模拟还可以揭示酶表面与纳米材料的相互作用，特别是在固定过程中，这对传感器性能非常重要。之前的界面MD研究主要探讨了酶在自组装单层涂覆的金表面的吸附[9]，然而LAC与类似石墨烯的纳米材料（如单壁碳纳米管）的相互作用尚未得到充分研究。值得注意的是，固定在石墨烯上的LAC表现出比在带电表面上更强的结合能力，同时保持了结构完整性[10]。

开发基于酶的电化学传感器的一个主要挑战是在LAC的深度嵌入的氧化还原中心与电极表面之间实现高效的电子转移[11]。包括羧基功能化的单壁碳纳米管（-COOH-SWCNTs）在内的碳纳米材料已被广泛用于克服这一限制，通过提高导电性、促进直接电子转移并提供较大的酶固定表面积[12]、[13]。当集成到丝网印刷碳电极（SPCEs）上时，-COOH-SWCNTs可以产生可扩展且低成本的传感平台，适用于快速食品分析。

LAC是一种多铜氧化酶，其催化的T1铜位点埋藏在蛋白质基质中，这可能阻碍电子直接转移到电极。-COOH-SWCNTs的集成通过提供高导电性的界面和较大的表面积来增强电子转移，允许酶以有利的方式定向并与电极紧密接触。SWCNTs上的羧基促进LAC的共价或静电固定[14]，减少了电子隧穿的距离，实现了准直接或直接的电子转移路径。这种界面工程加速了电荷转移，增强了酪胺氧化的电化学响应，提高了传感器的灵敏度和操作稳定性，为LAC-SWCNT生物传感器的设计提供了坚实的理论基础[15]。

LAC属于多铜氧化酶家族，在真菌、植物和微生物中广泛存在。它表现出广泛的底物特异性，能有效催化酚类化合物的氧化[14]、[16]、[17]，包括酪胺，后者含有来自酪氨酸脱羧的酚基团。其催化机制涉及电子丰富的底物的氧化与分子氧的四电子还原成水，过程中还原的LAC将电子转移给O2，同时生成可通过电化学方法监测的电活性中间体[18]。这一机制使得LAC适用于生物传感应用，能够在复杂的食品基质中实现敏感、选择性和无标记的酪胺检测[16]、[19]、[20]、[21]。

电化学技术如差分脉冲伏安法（DPV）和计时安培法（CA）提供了检测低浓度电活性分析物的敏感可靠的方法。DPV通过最小化背景电流来提高分析物的分辨率，而CA提供了关于传感器动力学和稳定性的实时信息。这些方法已广泛应用于酶基生物传感器，包括基于酪氨酸酶的儿茶酚检测[22]和基于二胺氧化酶（DAO）的组胺生物传感[23]。一种结合了六氰合铁酸盐（III）的DAO/SPCE生物传感器实现了低检测限和长期稳定性，突显了CA在简单和微型化生物传感平台中的有效性。

在这项研究中，进行了计算建模，包括分子对接和MD模拟，以阐明LAC-TYM复合物的结合机制和结构稳定性，揭示了负责底物识别的关键相互作用。基于这些原子级见解，通过将酶固定在-COOH-SWCNT改性的SPCEs上，开发了一种基于LAC的电化学生物传感器。原子力显微镜（AFM）和场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析证实了酶的有效固定，而DPV和CA显示出了高灵敏度、选择性和操作稳定性，进一步通过添加了酪胺的鸡肉样品进行了验证。这种结合计算和实验的方法提供了分子水平的理解和LAC-TYM相互作用的实际验证，为计算引导的生物传感器设计和食品质量监测建立了坚实的基础。

部分摘录

分子对接

进行分子对接实验，以研究LAC和TYM之间的结合相互作用，并阐明与生物传感器设计相关的底物识别机制。从蛋白质数据库（PDB）中获取了Trametes versicolor LAC的晶体结构（PDB ID: 1GYC）。结构预处理在加州大学旧金山分校开发的分子可视化程序UCSF Chimera [24]中进行，去除了晶体水分子、离子和非必需的成分

材料和试剂

来自Trametes versicolor的漆酶（LAC，EC 1.10.3.2）（≥0.5 μg^?1）、原始单壁碳纳米管（SWCNTs）、铁氰化钾（K4[Fe(CN)6）、铁氰化钾（K3[Fe(CN)6）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、六氰合铁酸盐(III)、酪胺、精胺、腐胺、L-酪氨酸、精胺、磷酸二钠（Na2HPO4）和磷酸一钠（NaH2PO4）均从Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）购买。硝酸（HNO3，65%）、硫酸（H2SO4）也用于实验

结果与讨论

使用HDOCKLite对TYM与LAC链A进行盲对接，发现靠近T1铜区域的表面可接触口袋是首选的结合位点。生成了五种对接构象（表1），对接得分范围从?151.18到?129.65。得分最低的模型1（?151.18）被选为LAC和TYM之间最稳定的复合物[40]。

在选定的对接构象（模型1）中，TYM被容纳在一个主要为疏水的腔内

形态学表征

进行了FESEM分析，以检查每个制备步骤对应的表面形态变化，如图6所示，并与图1中的制备方案相对应。未经改性的SPCE（图6A）显示出相对光滑且均匀的碳表面。经过羧基功能化SWCNTs修饰后（图6B），电极表面变得明显粗糙，形成了多孔且纠缠的纳米结构网络，增加了可用表面积

结论

本研究结合了分子对接、MD模拟和电化学验证，阐明了TYM与LAC的相互作用，从而开发出了LAC–COOH-SWCNT/SPCE生物传感器。计算分析显示酪胺在LAC的T1铜位点上有良好的结合，这种结合通过氢键和疏水相互作用得到稳定，Glu460和Pro346被确定为对复合物稳定性有贡献的关键残基。这些发现与电化学结果一致

作者贡献

N.H.M.参与了生物传感器平台的设计和表征，进行了分子对接和分子动力学模拟，起草了手稿并分析了酶-底物相互作用。M.N.A.B.分析了分子动力学模拟的数据，S.A.监督了生物传感器的制备，构思了研究框架并监督了整个项目，M.A.M.J.分析了酶-底物相互作用和分子动力学模拟，N.H.Mi监督了生物传感器的制备

CRediT作者贡献声明

Nurul Hana Mas'od：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，可视化，验证，软件，方法学，研究，数据分析，概念化。Mohammad Nazri Abdul Bahari：撰写 – 审稿与编辑，验证，软件，研究，数据管理。Syaza Azhari：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督，资源管理，项目管理，研究资金获取，概念化。Mohamad Arif Mohamad Jamali：撰写 –

未引用的参考文献

[52], [53], [54], [55], [62]

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了马来西亚高等教育部（MOHE）通过基础研究资助计划（FRGS-RACER）[资助代码：USIM/FRGS-RACER/FST/50919）的财政支持。我们感谢马来西亚伊斯兰科学大学（USIM）的科学技术学院在整个研究过程中提供的研究设施。