肠道病毒A71（EV-A71）是一种无包膜的单链正链RNA病毒，属于Picornaviridae科，是手足口病（HFMD）的主要致病因子。EV-A71对公共卫生构成重大威胁，因为它可以侵入中枢神经系统，导致严重的神经系统并发症，尤其是在幼儿中。自1974年在美国首次被发现以来，亚太地区多次发生大规模疫情[1,2]。虽然手足口病通常表现为5岁以下儿童的手脚和口腔黏膜上的水疱性皮疹，但某些EV-A71菌株具有神经亲和性，可引发无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹和脑炎[3,4]。这类重症病例导致高发病率和死亡率，给医疗和社会经济带来沉重负担。此外，由于缺乏世界卫生组织（WHO）批准的疫苗，EV-A71感染带来的公共卫生风险进一步加剧。
早期和准确的诊断仍然具有挑战性，因为手足口病的皮肤病变在临床上常与水痘、麻疹或单纯疱疹病毒感染难以区分[5]。因此，误诊或延迟检测会妨碍及时治疗和控制，从而加速病毒传播并增加长期神经系统后遗症的风险[6,7]。EV-A71主要通过粪-口途径和呼吸道途径传播，包括通过感染者的唾液、痰液或粪便。环境暴露，尤其是受污染的废水，也促进了肠道病毒感染的流行，使得废水处理设施成为病毒控制的关键且具有挑战性的干预点[8]。
目前，尚无抗病毒药物被批准用于治疗EV-A71感染，且完全许可的疫苗仅在中国和台湾可用。因此，开发快速准确的诊断方法对于有效管理患者和预防疫情至关重要。传统上，EV-A71的鉴定依赖于将临床样本接种到人类或灵长类细胞系（如RD、HEK293、HeLa和Vero细胞）中进行病毒分离[9]。然而，这些基于细胞培养的检测方法耗时且灵敏度较低，尤其是在感染早期。因此，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和核苷酸测序在内的分子诊断技术已成为临床检测的标准方法[[10], [11], [12], [13]]。其中，针对VP1区域的RT-PCR检测方法能够高灵敏度和特异性地检测和分型EV-A71。然而，这些分子方法需要复杂的样本预处理、专用热循环仪器和受过培训的人员，并且通常成本高昂、分析时间较长[14]。此外，由于EV-A71是一种热不稳定的RNA病毒，临床样本的储存或运输不当可能导致RNA降解，从而降低检测效率[15]。
鉴于EV-A71感染导致的快速临床进展和潜在的神经系统并发症，迫切需要一种快速、简单且可在现场使用的诊断平台以促进早期检测。在这种情况下，生物传感器技术作为一种有前景的替代方案应运而生，能够实现病毒病原体的灵敏、特异性和用户友好的检测，同时克服了传统分子检测方法的若干局限性。其中，光学生物传感器——尤其是比色平台——因其直观的视觉读数、最低限度的仪器要求以及适用于即时检测（PoC）部署而具有吸引力[[16], [17], [18]]。这些特点与对便携式、成本效益高的诊断系统的日益增长的需求高度契合，这些系统能够实现实时病毒监测并支持疫情控制。
M13噬菌体是一种高度可适应的EV-A71抗原生物识别平台，结合了结构稳定性、可调功能性和强目标特异性。噬菌体展示（生物淘选）是一种强大的组合技术，通过反复的结合、洗涤、洗脱和测序循环选择高亲和力肽，所得配体广泛应用于治疗、成像、诊断和生物传感[19,20]。值得注意的是，M13噬菌体具有由大约2700个主要外壳蛋白（pⅧ）和5个次要外壳蛋白（pⅢ、pⅥ、pⅦ和pⅨ）组成的丝状结构[21,22]。
在次要外壳蛋白中，pⅧ和pⅢ可以通过基因工程或化学修饰进行位点特异性功能化。这些特性使M13噬菌体不仅能够作为肽载体，还能够作为化学可修饰的生物识别平台，通过多价相互作用放大检测信号[[23], [24], [25]]。例如，Lee等人[26]开发了一种与辣根过氧化物酶（HRP）-链霉亲和素（SA）结合的生物素化黑曲霉孢子结合噬菌体，实现了对微量孢子的超高灵敏度比色检测，其性能优于传统的抗体基方法。综上所述，M13噬菌体作为一种稳健且多功能的分子探针，在临床和环境样本中检测病毒、细菌和真菌目标方面表现出色。
在本研究中，我们展示了基于噬菌体的比色传感器在快速选择性地检测EV-A71方面的潜力。通过M13噬菌体展示技术筛选和鉴定出具有高亲和力的特异性噬菌体。通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯化学方法将M13噬菌体的主要外壳蛋白（pⅧ，约2700个拷贝）进行生物素化，以实现与SA-HRP复合物的多价结合。通过优化连接链长度和间隔物（NHS-生物素、LC、LC-LC和PEG4），最小化了空间障碍并增强了信号暴露。利用ABTS比色法检测EV-A71，产生可见的绿色信号，从而通过放大强度实现微量样本的定量。M13噬菌体支架凭借其超多价和多功能特性，提供了强大的信号增强和生化稳定性，在成本、灵敏度和检测速度方面优于传统的分子和免疫诊断方法。
