胰腺癌起源于胰腺腺泡细胞或导管上皮细胞，是全球最具侵袭性和致命性的恶性肿瘤之一[1]。早期诊断和随后的手术切除可以显著提高患者的五年生存率[2]。然而，由于早期症状不明显，大多数患者在确诊时已经错过了手术机会，导致总体五年生存率非常低[3]。开发简单、可靠、成本低廉且无创的胰腺癌早期诊断方法具有重要意义。血清肿瘤标志物检测作为一种无创方法，在胰腺癌的早期诊断和治疗效果监测中起着关键作用。碳水化合物抗原199（CA199）是用于此目的的最广泛使用的生物标志物[4]。然而，单个生物标志物的敏感性和特异性仍有待提高[5]。例如，Lewis A抗原阴性的患者可能会出现CA199检测假阴性结果[6]。此外，某些良性情况或其他恶性肿瘤也可能导致CA199水平升高，从而产生假阳性结果。这些因素会影响CA199的诊断准确性[7]。为了提高诊断精度，研究人员提出了同时检测多种肿瘤标志物的方法。除了CA199之外，癌胚抗原（CEA）也是胰腺癌诊断的另一个重要标志物[8]。CEA水平在胰腺癌患者中通常显著升高，尤其是在Lewis A抗原阴性的患者中，具有互补的诊断价值。因此，快速、高灵敏度地同时检测CA199和CEA对于改善胰腺癌的早期诊断和治疗监测具有巨大潜力。
目前，肿瘤生物标志物的检测主要依赖于免疫测定，这些方法根据所使用的检测信号类型进行分类，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[9]、化学发光（CL）免疫测定[10]、荧光免疫测定[11]、电化学免疫测定[12, [13, [14]]以及电化学发光（ECL）免疫测定[15, [16, [17]]。然而，ELISA和CL测定的灵敏度有限，这限制了它们在癌症筛查和早期诊断中的有效性。相比之下，ECL技术结合了电化学方法和化学发光，显著提高了灵敏度[18]。ECL通过电极施加电化学激发，触发电极反应产物或溶液中特定组分之间的化学反应，从而产生光发射[19,20]。与CL相比，ECL反应是电化学控制的，提供了更好的时间和空间精度[21]。此外，ECL还集成了光电倍增管（PMT）来收集信号，实现了光发射的二次放大，大大提高了检测灵敏度。与荧光方法不同，ECL不需要外部光源，减少了背景干扰，提高了信噪比，并简化了仪器设备[22]。这些特性使ECL特别适合高灵敏度检测肿瘤生物标志物。尽管有这些优势，目前的基于ECL珠子的免疫测定方法仍面临挑战。这些方法通常依赖于复杂的夹心免疫测定格式、昂贵的抗体-生物素系统，以及需要昂贵的自动化仪器和熟练的操作人员。此外，常用的发射体如三(2,2′-联吡啶)钌（tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium）这种昂贵的金属复合物，进一步增加了试剂成本。因此，开发简单、高灵敏度的ECL分析系统，用于低成本、灵敏度和同时检测CA199和CEA是非常有意义的。
传统的ECL系统通常基于由发射体和共反应物组成的二元系统[22, [23], [24]]。引入共反应物显著提高了激发态物质的生成效率，从而增强了ECL信号。然而，这种二元系统的发射强度受到共反应物内在反应性的强烈影响。为了解决这一限制，最近提出了包含发射体、共反应物和共反应物增强剂的三元ECL系统[25, [26], [27]]。共反应物增强剂在电化学反应过程中增加了共反应物衍生物自由基的生成，从而显著提高了ECL强度[28]。酶因其能够从共反应物生成更多反应性中间体而被认为是有效的共反应物增强剂，从而改善了反应动力学和检测灵敏度。鲁米诺是一种经典且经济的ECL发射体，其ECL过程通常包括电化学氧化和活性氧（ROS）的生成[29,30]。除了过氧化氢（H2O2）外，溶解氧（DO）作为一种稳定的无毒性ROS来源也具有吸引力。在鲁米诺-DO系统中，ROS通过氧还原反应（ORR）生成，然后与氧化的鲁米诺反应形成发光的激发态物质。然而，DO向ROS的转化效率低以及鲁米诺在中性条件下的发光效果差，限制了其在血清等生理样品中的应用。将酶作为共反应物增强剂可以有效催化DO的还原，产生更多的ROS，从而在中性条件下增强鲁米诺-DO ECL信号，并扩展其应用范围至肿瘤生物标志物检测。此外，具有类似酶催化活性的合成纳米材料纳米酶已成为强大的共反应物增强剂[31]。与天然酶相比，纳米酶在极端条件下具有更高的稳定性，且合成更为简便[32, [33], [34], [35]]。因此，基于纳米酶的三元ECL系统代表了提高ECL测定灵敏度和稳健性的有前景策略。
为了进一步提高ECL性能，通常在电极表面使用基于纳米材料的载体来固定大量纳米酶。其中，垂直排列的介孔二氧化硅薄膜（VMSF）因其明确的纳米结构和可调的物理化学性质而受到广泛关注[36, [37], [38], [39]]。VMSF由高度有序、均匀的纳米通道组成，通道直径约为2-3纳米，长度为20-200纳米，孔隙密度高达75,000孔/μm2[40, [41], [42]]。这些结构特性赋予VMSF多个优势。首先，其刚性的三维框架和双域结构增强了电极的稳定性和重复性[43, [44], [45]]。此外，将纳米酶限制在通道内并与固定在外表面的抗体空间分离，有效减少了免疫识别和ECL发射过程之间的交叉干扰[46]。其次，纳米酶在超小介孔内的限制促进了反应中间体的局部富集，从而提高了催化效率和检测灵敏度。同时，这种受限环境有助于在恶劣条件下保持纳米酶的结构完整性和活性[47,48]。因此，将纳米酶整合到VMSF修饰的电极中可以提高三元ECL系统的灵敏度和操作稳定性，为高性能肿瘤生物标志物分析提供了一个多功能平台。
在这项工作中，CeO2纳米酶在VMSF的纳米通道内原位合成，构建了鲁米诺-溶解氧-CeO2纳米酶（luminol-DO-CeO2）三元ECL系统。结合在VMSF外表面组装的两个免疫识别界面，该设计实现了对两种肿瘤生物标志物的高灵敏度ECL检测。CeO2纳米酶表现出类似过氧化酶的催化活性和良好的稳定性，在中性条件下显著增强了鲁米诺-DO系统的ECL信号。此外，VMSF纳米通道的入口经过环氧基团修饰，以共价固定针对CA199或CEA的抗体，形成了两种免疫传感器。抗原-抗体复合物的形成导致ECL响应减弱，从而实现了对CA199和CEA的敏感和同时定量。
