利用全细胞SELEX技术开发基于适配体的沙门氏菌快速诊断检测法

《Microbiology Spectrum》：Development of an aptamer-based rapid diagnostic assay for Salmonella detection using whole-cell SELEX technique

本文推荐一项适配体快速诊断新技术：通过全细胞SELEX筛选出特异性识别沙门氏菌的DNA适配体，并与银纳米颗粒（AgNPs）结合，构建了一种无需复杂仪器、肉眼可见的颜色变化（比色法）检测平台。该研究为资源匮乏地区提供了高特异性、高灵敏度且低成本的病原体现场检测新方案。

　　

开发基于适配体的沙门氏菌快速诊断检测法：利用全细胞SELEX与纳米颗粒比色技术

摘要

快速、准确地检测沙门氏菌对于改善食品安全和减轻肠道感染负担至关重要，特别是在资源匮乏地区。基于适配体的诊断平台因其高特异性、稳定性和低生产成本，成为基于抗体方法的有前景的替代方案。本研究通过系统进化配体指数富集（SELEX）的迭代筛选轮次，开发了一种靶向肠道沙门氏菌的DNA适配体。通过比色法和分光光度结合试验监测靶标结合效率。合成了银纳米颗粒（AgNPs），并通过直接吸附与候选适配体偶联。通过将适配体-AgNP复合物暴露于浓度范围在10²至10⁸CFU/mL的沙门氏菌连续稀释液中进行斑点印迹比色分析。在硝酸纤维素膜上目视评估聚集情况，并基于吸光度强度和峰波长移动通过紫外-可见分光光度计进行定量。对照包括单独的AgNPs和相关非靶标细菌（大肠杆菌）。最终富集的适配体库使用Nextseq 550 Illumina平台进行测序，以确定特定序列并预测候选二级结构，用于未来大规模生产。适配体筛选显示出渐进性富集，从第8轮开始出现显著的斑点印迹信号和聚集，经过12轮SELEX后结合力强。当暴露于沙门氏菌时，适配体-AgNP复合物表现出浓度依赖性的聚集响应，在细菌浓度为10⁵CFU/mL时可观察到目视检测，并且与大肠杆菌相比，对沙门氏菌具有选择性结合，从10⁵CFU/mL起可通过分光光度法定量。峰值吸光度从靶标浓度为10²CFU/mL时的0.31 AU增加到10⁸CFU/mL时的1.73 AU，波长从504 nm红移至525 nm，表明纳米颗粒发生聚集。在对照样品中未观察到特异性聚集或光谱移动。富集的候选适配体被识别和优先排序，它们展现出保守的二级结构，包括发夹、多分支环和内部凸起，预计这些结构有助于与沙门氏菌外膜蛋白或脂多糖O抗原发生特异性相互作用。本研究证明了适配体与AgNP比色检测相结合在沙门氏菌灵敏和特异性检测方面的诊断适用性。未来的工作应专注于基于序列的化学修饰，以增强适配体的固定和检测性能，从而促进该平台在用于即时检测应用的大规模生产期间适应侧向层析形式。

重要性

本研究满足了沙门氏菌检测对快速、低成本、灵敏诊断工具的关键需求，特别是在传统方法往往难以获得或耗时的资源匮乏地区。通过利用银纳米颗粒开发基于适配体的比色检测法，该研究提供了一种高度特异性、灵敏且经济实惠的现有诊断替代方案。使用通过SELEX选择的DNA适配体能够精确识别沙门氏菌表面标记物，而比色读数无需复杂仪器即可实现轻松目视检测。该检测法的灵敏度证明了其在早期和现场水平病原体检测中的实际效用。重要的是，在适配体表征中纳入新一代测序增强了对适配体-靶标相互作用的分子理解，并支持未来在侧向层析检测中应用的检测方法改进。研究结果支持将该平台转化为即时检测形式，有助于发展中地区的食品安全监测和传染病控制。

引言

沙门氏菌是导致沙门氏菌病的一种重要致病菌，沙门氏菌病是一种影响人类和动物的全球性主要食源性疾病。仅非伤寒沙门氏菌每年就导致约9380万病例和155，000例死亡，其中撒哈拉以南非洲地区在侵袭性感染中承受不成比例的负担，儿童和免疫功能低下个体的病死率可能超过20%。沙门氏菌属包括两个种：肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌，其中肠道沙门氏菌是导致全球人类疾病和食源性疾病暴发的原因，尤其是鼠伤寒血清型和肠炎血清型。根据世界卫生组织的数据，不安全的食品每年导致约6亿例食源性疾病和42万例死亡，其中沙门氏菌是主要贡献者。这一负担在低收入和中等收入国家尤为沉重，那里缺乏清洁水、卫生设施、诊断服务和医疗保健系统加剧了影响。

传统的诊断技术，如基于培养的检测和聚合酶链反应（PCR），广泛用于沙门氏菌检测，并且仍然是金标准。然而，这些方法耗时、费力，并且需要专门的基础设施和训练有素的人员。这些限制限制了它们在暴发环境和资源有限环境中的效用。此外，抗菌素耐药性沙门氏菌菌株日益增长的威胁使治疗工作复杂化，并进一步强调了快速、准确和可现场部署的诊断工具的迫切需要。在此背景下，迫切需要可在护理点或现场环境部署的简单、快速且有效的诊断方法。这些工具不仅对于及时检测沙门氏菌感染至关重要，而且对于监测新出现的耐药菌株也至关重要。早期准确的诊断支持及时的临床决策，有助于控制疫情暴发，并加强公共卫生应对。一种低成本、用户友好且灵敏的平台，例如基于适配体的快速检测，弥合了当前的诊断差距，为改善临床和食品安全领域的检测和控制提供了实用的解决方案。其他研究强调了适配体在增强用于生物分子检测的斑点印迹检测法的灵敏度、特异性和多功能性方面的强大作用。基于适配体的生物传感器已在食品基质和现场样品中显示出有效应用，突显了其实用性。其简单性和特异性使其适用于临床、食品安全和环境监测的现场应用。通过实现早期检测，这种方法有助于改善沙门氏菌监测，并有助于减少不必要的抗生素使用，支持抗菌素耐药性控制工作。

基于适配体的生物传感器因其高特异性、稳定性和适应性而成为一类有前景的诊断平台。适配体是通过SELEX过程选择的短的单链DNA或RNA寡核苷酸。它们特异且紧密地结合其靶标，并具有相对于抗体的若干优势，包括热稳定性、靶标识别、化学灵活性和成本效益高的合成。这些特性使得适配体对即时检测应用和生物传感器开发特别有吸引力。

研究已经证明了基于适配体的沙门氏菌检测平台的有效性，包括实现有效检测的电化学适配传感器以及利用空心氮化碳纳米球检测鼠伤寒沙门氏菌的荧光适配传感器。此外，一种采用全细胞SELEX衍生适配体的阻抗生物传感器可在10分钟内检测肠炎沙门氏菌。其他研究开发了一种使用聚二乙炔-脂质体结合物的比色适配传感器，可在15分钟内产生肉眼可见的结果。比色纳米颗粒，特别是银和金，具有很强的表面等离子体共振特性，能够在聚集时实现可见的颜色变化，使其成为基于适配体的生物传感器中强大的信号转换器。其大的表面积与体积比也允许高密度适配体固定，从而增强了在资源有限条件下检测沙门氏菌等病原体的灵敏度和动态范围。

最近使用全细胞SELEX的适配体选择进展显著增强了针对沙门氏菌等细菌病原体的快速诊断工具的开发。与依赖纯化靶标的传统方法不同，全细胞SELEX能够在事先不了解其表面蛋白的情况下选择特异性结合活细菌细胞的适配体，从而识别其天然构象中的完整表面标记物。这提高了基于适配体的检测法的特异性和诊断性能。适配体的二级结构，特别是茎环、凸起和多连接基序，在定义靶标识别方面起着关键作用，因为这些构象形成了与沙门氏菌表面分子高亲和力相互作用所必需的独特三维结合口袋。此外，稳定的二级结构能够实现有效的功能化，例如用于纳米颗粒结合的硫醇或氨基修饰，从而确保生物传感平台的特异性和结构弹性。这些结构和功能序列折叠支持将基于适配体的识别元件集成到即时检测平台，如侧向层析检测，为复杂样品中沙门氏菌属的灵敏和选择性检测提供了有前景的替代方案。通过能够生成识别病原体整体表面结构的适配体，这种方法对于像肠道沙门氏菌这样具有多种抗原谱的复合生物体特别有价值。本研究旨在开发和验证一种快速、灵敏和特异的基于适配体的诊断检测法，用于沙门氏菌检测，该方法结合了全细胞SELEX与纳米颗粒介导的比色信号转导。除了SELEX富集之外，这项工作强调通过基于丰度、保守的结构基序和预测的稳定性对序列进行优先排序来进行严格的候选选择，以确保适合偶联、固定和稳健的性能。

材料与方法

单链DNA生成

使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit从混合血清型培养物中经确认的肠道沙门氏菌分离株中提取基因组DNA。裂解细菌细胞，并通过离心柱提取方案纯化DNA。使用Qubit荧光计评估提取DNA的浓度和纯度。通过将双链DNA在95°C加热10分钟使其变性，然后在冰上快速冷却以获得线性单链DNA。为了产生适合SELEX的短单链DNA片段，分别在37°C下用EcoRI和HindIII限制性内切酶消化基因组DNA1小时以减少DNA片段大小。使用Qiagen纯化试剂盒纯化消化产物。

用于适配体筛选的全细胞SELEX

细胞SELEX进行了14个迭代轮次，以分离对混合培养的肠道沙门氏菌血清型具有高亲和力和特异性的单链DNA适配体。初始DNA文库从经确认的肠道沙门氏菌分离株的提取基因组DNA生成。基因组DNA被酶切成片段以产生短DNA片段，随后在选择前转换为单链DNA。在每轮SELEX开始时，将DNA池在95°C热变性5分钟，并立即在冰上快速冷却5分钟以确保链分离。然后将单链DNA池在室温下孵育10分钟，以便在靶细菌细胞孵育前重新折叠成二级结构。在每轮SELEX中，将10⁶CFU/mL的活沙门氏菌全细胞与单链DNA文库在结合缓冲液中于37°C孵育，时间从1小时（早期轮次）到10分钟（后期轮次）不等，随着选择严格性的增加，孵育时间减少。与完整细菌细胞孵育后，通过多次洗涤步骤去除未结合的单链DNA序列，并通过热变性回收靶标结合的适配体，使其从细菌表面解离。在每个SELEX轮次中一致地应用这种变性-重折叠循环，以维持单链性并促进稳定、可再现的DNA构象形成。在越来越严格的条件下进行的迭代选择逐步富集了高亲和力的靶标结合序列，同时消除了非结合或弱折叠的片段。洗涤严格性在SELEX周期中逐步增加，以富集高亲和力结合物，早期轮次洗涤最少，而后期轮次则纳入更严格的洗涤以消除低亲和力或非特异性序列。第12轮回收的单链DNA使用商业随机引物进行扩增，以为下一个循环再生文库。

银纳米颗粒合成和适配体偶联

使用硝酸银的化学还原法合成银纳米颗粒。制备2 mM的硝酸银溶液并在连续搅拌下加热至80°C。在受控的温度和pH条件下，通过添加柠檬酸盐作为合适的还原剂来合成银纳米颗粒。将反应混合物保持在加热和搅拌下30分钟，直到颜色从淡黄色变为浅棕色，表明银纳米颗粒成功形成。然后将溶液冷却至室温，以8000 rpm离心15分钟进行纯化，并将所得沉淀重新悬浮在1 mM柠檬酸三钠中。将胶体银纳米颗粒储存在避光的容器中，4°C保存，直至使用。为了制备适配体-AgNP结合物，将选定和筛选的单链DNA适配体候选物在95°C加热5分钟，并在冰上快速冷却进行退火。为了形成3D结构，将适配体在室温下放置10分钟，然后将适配体与AgNP以1:10的比例混合，并在优化条件下孵育。通过被动吸附实现偶联，在室温下孵育2小时，每10分钟颠倒一次。然后将混合物以8000 rpm离心10分钟以去除未结合的适配体，并将沉淀的结合物重新悬浮在pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水中。通过使用UV-1800分光光度计观察吸光度峰值的移动来确认成功偶联。

用于靶标结合和检测限测试的斑点印迹检测法

使用斑点印迹检测法评估适配体-AgNP结合物的结合亲和力和特异性。制备肠道沙门氏菌和非靶标大肠杆菌，方法是从过夜培养的胰蛋白酶大豆肉汤中收获细胞，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并通过在95°C煮沸10分钟来杀死细菌培养物。然后，将每种单独的已杀死和活细胞的3 μL点样到硝酸纤维素膜上，并在室温下风干30分钟以固定样品。将膜用含5%聚乙二醇和0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲盐水溶液封闭1小时，以减少非特异性结合。封闭后，在每个靶标点样点上点加3 μL适配体-AgNP结合物，并在室温下孵育20分钟。通过用含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲盐水洗涤膜三次以去除未结合的结合物。适配体-AgNP结合到沙门氏菌细胞的位置通过膜上出现紫蓝色聚集体来可视化特定结合。为了确定检测限，将浓度范围为10⁸至10¹CFU/mL的肠道沙门氏菌连续稀释液如上所述点样到膜上，记录产生可见紫蓝色聚集的最低浓度作为检测限。设计的检测法通过适配体-靶标与表面相关分子基序的特异性结合来检测沙门氏菌的存在，且不依赖于细菌活力。阴性对照包括大肠杆菌细胞和磷酸盐缓冲盐水点样点，用于评估非特异性结合和背景信号。

使用分光光度计进行靶标结合和检测限测试

使用UV-1800分光光度计评估AgNP-适配体复合物对肠道沙门氏菌的结合和检测限。将AgNP-适配体结合物与浓度范围为10⁸至10¹CFU/mL的10倍连续稀释的肠道沙门氏菌混合，并在室温下孵育15分钟。孵育后，将每个反应混合物的1 mL转移到1 cm光程的石英比色皿中。在每次测量前使用蒸馏水对分光光度计进行调零。在300-800 nm波长范围内记录吸收光谱，特别关注对应于细菌浓度和结合效率的局域表面等离子体共振峰移动。每个样品以400 nm/min的速度和1 nm的光谱带宽进行扫描。峰值波长处的吸光强度以及相应的峰波长移动均由仪器软件自动记录，并分别作为细菌浓度的函数进行分析。对照样品包括未偶联适配体的AgNP以及与10⁶CFU/mL非靶标大肠杆菌细胞孵育的适配体-AgNP结合物，在相同条件下进行分析以进行比较。

适配体扩增、文库制备和测序

使用商业随机引物对富集的单链DNA序列进一步扩增适配体候选物。在优化的热循环条件下进行PCR：95°C初始变性3分钟；随后进行20个扩增循环：95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒；最后在72°C延伸5分钟。通过2.5%琼脂糖凝胶电泳分析所得PCR产物，以确认扩增特异性和大小。在文库制备前，使用Qubit 1× dsDNA HS Assay Kits对纯化的PCR产物进行定量。使用Illumina DNA Prep Kit按照制造商的建议进行文库制备。根据制造商的指南，首先使用珠连转座酶和片段化缓冲液1对纯化和PCR扩增的单链适配体进行转座。为了实现多重测序，将独特的双索引接头连接到转座片段上，并使用Illumina纯化珠进行文库清理，以选择性保留适合测序的文库大小。使用Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit评估最终文库的浓度，然后稀释至适当的起始浓度，以便在NextSeq 550平台上进行测序。测序就绪的文库用0.2 M氢氧化钠变性，并根据Illumina NextSeq 550标准方案稀释至最终上样浓度。将最终稀释的文库上样到测序芯片上，并使用自动上样系统在流动池上启动测序。测序完成后，仪器生成碱基识别文件，用于下游分析。根据读取频率、跨轮次富集程度、预测的二级结构稳定性和基序保守性对候选物进行排序。测序在埃塞俄比亚公共卫生研究所的整合病原体基因组学和生物信息学监测与研究设施进行。

数据分析

将原始数据导入SPSS 25版并进行清理，以识别和纠正任何缺失或不一致的条目。分析斑点印迹和吸光度数据以获得检测限信号强度，并使用紫外-可见分光光度法量化靶标结合，从而评估结合效率和检测灵敏度。结果以显示平均强度和吸光度值及标准差的条形图呈现，并在表格中总结了浓度范围、聚集信号响应和计算出的检测限。来自富集的适配体库的原始序列读取经解复用并转换为FASTQ格式。使用FastQC评估读取质量，并使用Trimmomatic修剪接头和低质量碱基。对于双端数据集，使用PEAR合并重叠读取以重建全长适配体序列。然后筛选处理后的读取以去除恒定引物结合区，并使用自定义脚本提取可变适配体结构域。识别独特序列并计算其相对丰度以确定最富集的候选物。使用Mfold预测富集的适配体候选物的二级结构，以支持比较分析和候选优先排序。预测的折叠模式代表计算得出的构象，并作为预测的结构排列呈现。这些预测用于识别保守基序和评估热力学稳定性。这评估了最小自由能、碱基配对模式、茎长度和环大小，从而评估结构稳定性。使用点括号符号记录包括发夹、内部凸起、多分支支架和多螺旋连接点在内的结构基序。将候选适配体映射到已知的沙门氏菌表面分子，包括外膜蛋白OmpC、OmpF、OmpA和脂多糖O抗原，以识别可能的相互作用位点。记录结构基序和预测的结合区域，以指导选择高亲和力适配体。根据读取频率、预测的结构稳定性和基序复杂性对适配体候选物进行排序，突出显示出具有强靶标结合潜力的序列。

结果

SELEX过程显示出在迭代筛选轮次中适配体结合效率的渐进性富集。初始筛选轮次（1-3）在斑点印迹信号上没有显示出可见的聚集，表明结合力弱或非特异性。从第8轮开始，观察到低强度的斑点印迹信号和轻微的聚集，表明开始出现靶标特异性。到第12轮时，出现强烈的斑点信号和高聚集水平。经过PCR扩增后，第13-15轮持续产生深度聚集，表明针对沙门氏菌的高亲和力适配体得到富集。检测依赖于对沙门氏菌特异性表面分子特征的识别，在活细胞和热灭活细胞中观察到相当的结合。

采用适配体偶联的AgNP的比色检测法在暴露于沙门氏菌时表现出清晰的浓度依赖性蓝色聚集响应。阴性对照，包括单独的AgNP、无细菌的AgNP-适配体结合物以及非靶标细菌（大肠杆菌），均未显示聚集。高沙门氏菌浓度（≥10⁷CFU/mL）引发强烈聚集和深色发展，对应于视觉强度评分+5。在10⁵–10⁶CFU/mL浓度下观察到中等聚集（强度评分+2至+4），而在较低浓度（10⁴CFU/mL）下仅观察到微弱或无聚集，评分为+1，在≤10³CFU/mL时未观察到可见聚集强度。

比色检测法显示吸光度强度与沙门氏菌浓度之间存在直接相关性。在低浓度（10²–10⁴CFU/mL）下，吸光度值保持较低，范围从0.31到0.45 AU，AgNP-适配体复合物没有聚集。随着浓度增加，观察到吸光度逐渐上升：10⁵CFU/mL时为0.76 AU，10⁶CFU/mL时为1.12 AU，10⁷CFU/mL时为1.51 AU。最大吸光度1.73 AU出现在10⁸CFU/mL时，表明由于靶标结合导致广泛的聚集。这些结果表明光学密度的剂量依赖性增强，纳米颗粒聚集水平和可见颜色变化不断增加。

AgNP-适配体结合物的峰值波长随着沙门氏菌浓度的增加而发生移动。在低细菌载量（10²–10⁴CFU/mL）下，峰值波长保持在504-507 nm附近，与最小的纳米颗粒聚集一致。当浓度上升到10⁵CFU/mL及以上时，波长逐渐向更长的值移动：10⁵CFU/mL时为510 nm，10⁶CFU/mL时为516 nm，10⁷CFU/mL时为521 nm，10⁸CFU/mL时达到峰值525 nm。表面等离子体共振的这种红移表明颗粒间相互作用和聚集增加，验证了适配体结合诱导的比色响应。随着沙门氏菌浓度的增加，观察到吸收峰波长出现明显的红移。最大吸收峰从10²CFU/mL时的501 nm移动到10⁸CFU/mL时的525 nm，表明由于靶标结合导致纳米颗粒聚集。对照条件（单独的AgNP或与大肠杆菌一起）保持较短的峰值波长，大约在407-412 nm，这是非聚集纳米颗粒的典型特征。峰值波长的移动提供了成功进行适配体介导检测的证据，并可作为比色生物传感器中定性分析的光谱特征。这些功能结果，结合测序分析，使我们能够从批量库结合过渡到优先选择单个适配体候选物，以备未来侧向层析检测应用。

使用斑点印迹和分光光度检测法进行的灵敏度评估表明，在沙门氏菌浓度≥10⁵CFU/mL范围内，信号辨别具有一致性和可重复性。虽然在10³CFU/mL时偶尔能观察到信号发展，但所施加的有限样品体积（每点3 μL）导致绝对细菌细胞数量非常低，产生的信号在背景水平附近不一致。因此，在当前检测条件下，10⁴CFU/mL被定义为可靠检测的实际下限。

在经过12轮SELEX和三轮额外连续富集后，对富集的适配体库进行测序，产生了多个高频率的候选序列。Apt-1（148 nt）被识别出10次，占顶级序列的22.2%。它表现出最低的最小自由能（-59.8 kcal/mol），表明热力学稳定性强。预测的二级结构分析揭示了具有发夹的堆叠茎环，最大茎长度为8 bp，环大小为8 nt。稳定性评分为0.933，结合评分为0.889。计算机模拟映射表明，主要通过静电、氢键和范德华力相互作用与保守的外膜蛋白（OmpC、OmpF和OmpA）和脂多糖O抗原结合。Apt-2（149 nt）出现9次，占库的20%。预测的二级结构是一个多分支连接点，具有中心茎环，最大茎长度为11 bp，环大小为7 nt。其最小自由能为-47.4 kcal/mol。稳定性评分为0.671，结合评分为0.798。预测的结合区域是脂多糖O抗原多糖。Apt-3（149 nt）是最频繁的序列，检测到11次（24.4%）。预测的结构包括具有内部凸起的发夹茎环，最大茎长度为13 bp，环大小为5 nt。最小自由能为-47.9 kcal/mol，稳定性评分为0.629，结合评分为0.742。预测的结合区域包括外膜蛋白（OmpC、OmpF和OmpA）。与Apt-1类似，Apt-4（149 nt）出现9次（20%），其预测结构特征为内部凸起和侧发夹，最大茎为11 bp，环大小为6 nt。最小自由能为-49.9 kcal/mol，稳定性评分为0.653，结合评分为0.699。预测的结合区域包括脂多糖O抗原多糖。排名前四的适配体候选物占富集库的86%以上。它们表现出多样的结构基序、有利的最小自由能值，稳定性和结合评分范围分别为0.629至0.933和0.699至0.889。预测的靶标区域包括外膜蛋白和脂多糖O抗原。

四种候选适配体的计算二级结构预测显示出多样化的折叠模式和茎环排列。

讨论

本研究证明了通过系统的全细胞SELEX过程成功选择、富集和表征沙门氏菌特异性DNA适配体，及其在比色检测中的应用。高亲和力适配体的渐进性富集通过从早期SELEX轮次（1-7）的非特异性响应到后期轮次（8-15）越来越特异和强烈的聚集信号的明显转变得到证明。特别是在第12轮及随后的PCR扩增之后，观察到高且一致的聚集强度，表明成功分离出对沙门氏菌靶标具有强结合亲和力的适配体。该结果与先前报道一致，表明在针对伯氏疏螺旋体表面蛋白CspZ的适配体开发过程中，后期SELEX循环的结合效率有所提高。类似地，另一项研究展示了杂交SELEX如何导致针对B7H3的高度特异性适配体的富集，后期轮次显示出更稳定的靶标相互作用和一致的结合。

使用与所选适配体结合的AgNP进行比色检测被证明能有效产生信号，对沙门氏菌表现出明显的浓度依赖性聚集响应。高细菌浓度（≥10⁷CFU/mL）产生深色的目视聚集和强烈的吸光度响应，而中等浓度（10⁵–10⁶CFU/mL）导致部分聚集。在低浓度（≤10⁴CFU/mL）下，仅观察到微弱聚集，而在≤10³CFU/mL时无聚集。阴性对照（单独的AgNP、无靶标的AgNP-适配体以及非靶标大肠杆菌）没有显示可见的聚集，证实了适配体在区分沙门氏菌与其他细菌物种方面的特异性和灵敏度。

分光光度分析进一步验证了检测法的性能，显示随着沙门氏菌浓度的增加，光密度（吸光度）和波长也相应增加。峰值吸光度值从10²CFU/mL时的0.31 AU增加到10⁸C