《Biomass and Bioenergy》：LRMS and HRMS-based metabolite profiling of
Scenedesmus almeriensis produced under variable salinity
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本研究评估了淡水微藻Scenedesmus almeriensis在淡水和海水培养条件下的酚类化合物及色素组成，首次通过超声辅助提取（甲醇-水80:20，10分钟）结合UHPLC-QqQ和HRMS-Q-Orbitrap方法，鉴定了58种化合物（7种经标准品确认），发现海水培养促进抗氧化物质和色素选择性积累，同时保持生物质产量和光合效率稳定。
埃利亚·里维拉-桑切斯（Elia Rivera-Sánchez）|赫苏斯·马林-萨埃斯（Jesús Marín-Sáez）|安东尼亚·加里多·弗雷尼奇（Antonia Garrido Frenich）|托马斯·拉法加（Tomás Lafarga）
阿尔梅里亚大学化学工程系，04120，阿尔梅里亚，西班牙
摘要
本研究评估了淡水微藻Scenedesmus almeriensis的植物化学成分，这种微藻也可以使用海水进行培养，重点关注酚类化合物和色素。据作者所知，这是首次在淡水和海水培养条件下对S. almeriensis的酚类成分进行比较和分子水平表征的研究。在优化了超声辅助提取工艺（使用80:20的甲醇-水混合物，时间10分钟）后，采用UHPLC-QqQ方法对分子如反式阿魏酸（104 μg kg?1）、丁香酸（27 μg kg?1）、儿茶素（12 μg kg?1）和芥酸（12 μg kg?1）进行了定量分析。通过高分辨率质谱（HRMS，Q-Orbitrap）、多变量建模（PCA、OPLS-DA，VIP >1.5）和单变量分析，初步鉴定出58种化合物，其中7种通过参考标准被确认为代谢物。这种方法超越了以往研究中常用的比色法，能够对酚类成分进行详细的分子分析。使用海水培养促进了抗氧化化合物和色素的选择性积累，同时没有显著影响生物量产量或光合效率，表明海水适应策略是调节淡水微藻植物化学成分以用于生物技术应用的可行方法。
引言
预计到2050年，世界人口将达到100亿。人口增长加上持续的工业化给食品生产和农业资源带来了巨大压力。据估计，食品需求可能增加56% [1]。在这种情况下，有必要寻找既经济又环保的可再生资源。
微藻作为一种有前景的替代品，有助于提高食品安全和改善环境质量 [2]。它们可以直接作为食品使用，主要用作食品着色剂或高质量蛋白质的来源 [3]；也可以间接用于生产食品，例如作为动物饲料成分或农业产品，如生物刺激剂和生物肥料。这些微生物可以促进作物生长和发育，提高养分利用效率，并减少对传统化学物质的依赖，从而推动更绿色的农业实践，生产出更健康、更有营养的食品 [4]。微藻的主要优势在于其快速生长能力以及能够利用不同类型的水（如废水或海水）进行培养。这些微生物富含生物活性分子，如色素、蛋白质、脂肪酸、多糖、维生素和酚类化合物，这些成分在食品、化妆品和营养保健品等多种产品的制备中具有广泛应用前景 [2,5,6]。
近期研究表明，不同微藻物种（包括Scenedesmus、Dunaliella salina、Chlorella minutissima和Nannochloropsis oculata）中的酚类化合物含量存在显著差异。在这些微藻中发现了多种黄酮类化合物，包括黄烷醇、黄烷酮、异黄酮和二氢查尔酮 [7,8]。这些酚类化合物在微藻生理过程中发挥多重作用，作为应对氧化、盐度和光照等环境压力的关键介质，有助于中和活性氧，提供辐射防护，并参与细胞信号传导和抵御病原体的防御机制。其中，黄酮类化合物因其广泛的生物活性（包括抗氧化、抗炎、抗菌和细胞毒性作用）而备受关注，这解释了它们在化妆品、食品和制药工业中的应用价值 [8,9]。其他研究还证实Scenedesmus菌株中含有阿魏酸、对香豆酸和没食子酸等特定酚类酸 [8]。然而，目前大多数研究主要采用传统的比色法（如Folin–Ciocalteu法）来测定总酚类和黄酮类化合物的含量。例如，?ktem等人 [10] 对一种耐热Scenedesmus菌株进行了研究，测得其乙醇/水提取物中的总酚类含量为5.40 ± 0.28 mg g?1。尽管这些信息有一定价值，但仍需要开发出能够选择性提取和分子分析这些化合物的协议，以最大化其生物技术价值 [7,11]。
微藻中酚类化合物的生物合成受到紫外线辐射、温度变化和光照强度等非生物因素的显著影响，这体现在它们适应环境变化的能力上 [8]。S. almeriensis是一种淡水物种，最近已被适应海水环境 [12]。在海水中培养这种微藻会导致其生物活性成分的变化 [12]。已有研究探讨了不同微藻物种的酚类成分，以及Scenedesmus属物种中酚类的提取和定量方法。然而，目前缺乏关于S. almeriensis在海水适应后的总酚类含量的具体比较评估。此外，尽管先前的研究表明盐度胁迫会改变微藻的酚类合成，但盐度对淡水菌株酚类成分的影响仍不明确 [13]。因此，本研究旨在通过低分辨率质谱（LRMS）和高分辨率质谱（HRMS，分别配备三重四极杆QqQ和Q-Orbitrap质谱仪）来量化总酚类化合物并鉴定代谢物，同时评估海水在生物量生产阶段对这些化合物的产生和积累的影响。
试剂和材料
所使用的试剂和溶剂均为分析级和HPLC级。超纯水来自Milli-Q系统（Merck Millipore，德国达姆施塔特），甲醇和乙醇购自Honeywell（美国新泽西州莫里斯敦）。甲酸（纯度>99%）购自Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）。Florisil?滤膜由Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供，用于样品清洗。BD Discardit? 2毫升和5毫升注射器（西班牙韦斯卡）以及Captiva尼龙注射器也用于实验。
生物量生产
首先从整体生理性能和生物量产出的角度评估了淡水和海水培养的差异。这些参数决定了海水培养策略的可行性。尽管暴露在海水环境中，S. almeriensis仍保持了稳定的生理功能，Fv/Fm值在整个生产期间保持在0.60至0.65之间（图1A）。这些数值处于正常范围内。
结论
研究表明，至少在实验室规模上，S. almeriensis可以使用海水进行培养。尽管生物量产量略有下降，但培养物仍保持了生理功能和光合效率，表明其已有效适应了海水环境，而非受到严重胁迫。
除了产量方面的考虑，海水培养还导致了生物量组成的选择性变化，有利于抗氧化相关代谢物的积累。
作者贡献声明
埃利亚·里维拉-桑切斯（Elia Rivera-Sánchez）：撰写初稿、研究、数据分析、概念构思。
赫苏斯·马林-萨埃斯（Jesús Marín-Sáez）：审稿与编辑、撰写初稿、验证、监督、软件应用、方法学设计、数据分析、数据管理、概念构思。
安东尼亚·加里多·弗雷尼奇（Antonia Garrido Frenich）：审稿与编辑、资源协调。
托马斯·拉法加（Tomás Lafarga）：审稿与编辑、监督、资源获取、资金筹措。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究属于SOLAR·FOODS项目（PID2022-136292OB-I00），由西班牙科学与创新部和欧盟资助；以及BLUE·FUTURE项目（PCM_00083），由安达卢西亚政府和欧盟资助。此外，该研究还得到了欧盟委员会通过Horizon Europe计划资助的COSEC项目（资助协议编号：101172850）的支持。托马斯·拉法加感谢西班牙科学部资助的Ramon y Cajal计划（RYC2021-031061-I）。
