揭示来自Boerhavia diffusa L.的RAAS调节萜类化合物Boerhadiffusene，并通过计算机模拟（in silico）和体外实验（in vitro）方法进一步探讨其潜在的降压活性

《Computational Biology and Chemistry》：Unveiling the RAAS-modulating terpenoid, Boerhadiffusene from Boerhavia diffusa L. and further envisage its potential anti-hypertensive activity through in silico and in vitro approaches

本研究通过化学纯化、计算建模和体外实验，系统评估了印度膝ensch草（Boerhavia diffusa）中分离出的萜类化合物boerhadiffusene的抗高血压和心脏保护作用。实验表明其具有优异的药物亲和性、膜渗透性和安全性，与RAAS关键靶点MR（结合能-11.99 kcal/mol）、Renin（-9.02 kcal/mol）及AT1R（-10.29 kcal/mol）存在强结合，且其与MR复合物的稳定性（RMSD≈0.20 nm）经分子动力学模拟验证。体外测试显示该化合物在20 μM浓度下即可逆转Ang II诱导的心肌细胞肥大，显著抑制α-Sk、β-MHC及BNP等病理标志物表达，且无细胞毒性。研究结果为开发新型MR靶向心血管药物提供了理论依据和实验支持。

　　

Kanagasabai Somarathinam|Seshan Gunalan|Anandh Sundaramoorthy|Suresh Dhanusu|Sherrie Jesulyn David|Arunkumar Anthony|Gugan Kothandan

印度泰米尔纳德邦金奈Avadi市Vel Tech High Tech工程学院物理系，Dr. Rangarajan和Dr. Sakunthala工程学院，邮编600 062

摘要

高血压及其相关的心脏肥大仍然是全球主要的健康挑战，亟需更安全、更有效的治疗药物。本研究通过植物化学纯化、计算建模和体外验证方法，探讨了从Boerhavia diffusa中提取的萜类化合物boerhadiffusene作为潜在的抗高血压和心脏保护药物的潜力。通过FT-IR、NMR和HR-MS分析对boerhadiffusene进行了纯化和结构鉴定。计算机模拟显示其具有优异的药物相似性、高膜通透性，并且没有突变性、肝毒性、心脏毒性或hERG-I抑制作用。分子对接实验表明，该化合物对关键的RAAS通路靶点（包括肾素（?9.02 kcal/mol）、AT1R（?10.29 kcal/mol）和盐皮质激素受体（MR；?11.99 kcal/mol）具有强结合亲和力，优于参考药物螺内酯（?9.50 kcal/mol）。分子动力学模拟证实了MR-boerhadiffusene复合物的稳定性（RMSD约为0.20 nm），支持其通过选择性拮抗MR发挥抗高血压作用。在H9C2心肌细胞中，boerhadiffusene在40 μM浓度下无细胞毒性，并能显著抑制Ang II诱导的心脏肥大（IC50约为20 μM），效果优于同等浓度的螺内酯。此外，它还能显著下调心脏肥大相关标志物（α-Sk、β-MHC、BNP），表明其具有强大的病理心脏重塑抑制作用。综上所述，这些理化、计算和生物学结果表明boerhadiffusene是一种有前景的天然MR靶向抗高血压候选物，具有很高的临床转化潜力。

引言

高血压影响了发达国家超过25%的成年人，是与心血管疾病（CVD）、肾脏疾病、中风和心肌梗死等并发症相关的重要健康问题。高血压的多因素病因涉及复杂的遗传、衰老和环境因素，因此需要有效的治疗干预措施[3]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）在维持电解质平衡和血管张力方面起着关键作用。RAAS级联反应始于肾素从肾小球旁细胞释放，随后将血管紧张素原转化为血管紧张素I（Ang I），再由血管紧张素转换酶（ACE）转化为血管紧张素II（Ang II）。Ang II是一种强效的血管收缩剂，会刺激醛固酮的释放，导致钠和水潴留，从而升高血压[4]。在RAAS组分中，位于关键器官中的血管紧张素II type 1受体（AT1R）是一种G蛋白偶联受体，在血管收缩、细胞增殖和纤维化过程中起重要作用。最新研究表明，AT1R参与了信号通路，包括活性氧（ROS）的产生以及酪氨酸激酶和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活[5, 6, 7]。值得注意的是，ROS在Ang II诱导的心肌细胞肥大中起着重要作用。相反，血管紧张素II type 2受体（AT2R）与细胞分化、组织修复和血管扩张等生理功能相关[8]。

RAAS组分的失调显著促进了高血压的发病机制，因此开发了针对RAAS的治疗药物。抗高血压治疗策略包括多种药物类别，如肾素抑制剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂和盐皮质激素受体（MR）拮抗剂。Aliskiren（ALS）是临床上使用的第一个非肽类肾素抑制剂，此外还有ACE抑制剂（如雷米普利）、MR拮抗剂（如螺内酯）和AT1R阻滞剂（如替米沙坦）[9, 10, 11, 12]。此外，人们越来越关注天然化合物作为传统高血压治疗方法的替代品。萜类化合物，尤其是橄榄烷三萜类，因其抗高血压潜力而受到重视[13, 14]。受这些发现的启发，我们的研究聚焦于Boerhavia diffusa（Punarnava），这是一种传统上被认为具有药用价值的夜来香科植物。B. diffusa含有丰富的植物化学成分，如单宁、黄酮类、生物碱、苷类、甾体、酚类和萜类，这些成分为其在治疗心血管疾病方面的应用提供了基础[15, 16]。

基于我们之前关于Convolvulus pluricaulis中五环三萜类化合物选择性调节盐皮质激素受体（MR）的研究结果[17]，本研究探讨了从Boerhavia diffusa中提取的萜类化合物boerhadiffusene作为潜在的MR靶向抗高血压候选物。研究目标是通过综合的计算机和体外方法，分离并全面表征boerhadiffusene，评估其与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）关键组分的分子相互作用和结合亲和力，以及其抗高血压效果、抗心脏肥大能力和在H9C2心肌细胞中的细胞相容性。

部分摘要

从B. diffusa中分离boerhadiffusene

该化合物通过硅胶柱色谱法从B. diffusa根部的乙酸乙酯（EtOAc）提取物中分离出来，使用的是97:03的己烷–EtOAc溶剂系统。HPLC分析显示在1.449分钟的保留时间处有一个主要峰，确认boerhadiffusene是提取物的主要成分。然而，单个HPLC峰并不能完全证明其纯度；可能仍存在微量的乙酸乙酯等残留溶剂。

结论

本研究表明，来自Boerhavia diffusa的萜类化合物boerhadiffusene是一种有前景的RAAS调节抗高血压候选物。综合计算和细胞分析显示，它与MR、肾素和AT1R具有强且选择性的相互作用，分子对接和动力学实验证实了其优先拮抗MR的作用。在H9C2心肌细胞中，boerhadiffusene表现出优异的细胞相容性，并显著抑制了Ang II诱导的心脏肥大。

样本采集

Boerhavia diffusa根株于2018年6月17日上午7点在印度泰米尔纳德邦金奈的Madras大学Guindy校区采集（纬度13.009° N，经度80.2384° E）。采集的Boerhavia diffusa样本（编号：MUBL1029）被存放在Madras大学植物学系的植物标本馆（MUBL）中。

提取与分离

Boerhavia diffusa的根部材料经过收集、彻底清洗、阴干后研磨成细粉。

试剂

Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、抗生素-抗真菌剂和胰蛋白酶-EDTA溶液均购自美国加利福尼亚州的Gibco公司。用于检测心脏肥大标志物的基因特异性引物来自美国Eurofins Scientific公司。RT-PCR cDNA合成试剂盒（编号639506）和绿色染料Emerald Amp GT 2X PCR Master Mix（编号RR320A）来自日本Takara Bio公司。所有其他化学品均为分析级，购自Sisco Research公司。

作者贡献声明

Gugan Kothandan：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源协调、方法设计、概念构思。Kanagasabai Somarathinam：初稿撰写、实验设计、数据分析。Seshan Gunalan：数据可视化、结果验证、软件应用。Anandh Sundaramoorthy：资源支持。Suresh Dhanusu：资源协调。Sherrie Jesulyn David：资源支持。Arunkumar Anthony：实验设计、数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。作者不是该期刊的编委会成员、主编、副主编或客座编辑，也未参与文章的审稿或发表决策过程。

致谢

通讯作者GK感谢印度医学研究委员会（ICMR）提供的计算支持（项目编号：2021-15766），同时感谢IBDC（印度生物数据中心）协助进行长期模拟实验。

作者贡献

Kanagasabai Somarathinam（KS）和Gugan Kothandan（GK）共同构思和设计了这项研究，全程监督项目并提供专业指导。KS还负责了光谱分析等工作。