综述：生物脱硫：通过合成生物学与代谢工程方法重回舞台

《Current Opinion in Biotechnology》：Biodesulfurization: Back on-stage through synthetic biology and metabolic engineering approaches

本综述聚焦于利用微生物选择性裂解C–S键的4S脱硫途径（Biodesulfurization, BDS），系统评述了其作为传统加氢脱硫（HDS）绿色替代方案的最新进展。文章深度整合了模式菌株红球菌（Rhodococcus）的性能调控与系统生物学研究，以及在革兰氏阴性菌（如假单胞菌Pseudomonas）平台上的操纵子重构与底盘设计策略，并探讨了从分子调控、过程限制到反应器操作的多层级工程挑战与整合前景，为推进BDS的工业化应用指明了方向。

　　

引言

燃油中的噻吩、二苯并噻吩（DBT）及其衍生物是主要的含硫有机化合物，燃烧时会释放硫氧化物（SO_x），加剧空气污染。传统的加氢脱硫（HDS）技术面临噻吩环固有稳定性的挑战，需要高能耗和高成本。因此，寻求成本效益高且环境可持续的替代技术成为持续需求。能够从有机硫化合物中去除硫的细菌于20世纪80年代末被发现，构成了现代好氧生物脱硫（BDS）的基础——这是一种利用微生物与燃油进行两相接触的生物过程，作为传统HDS的“绿色”替代方案。

红球菌（Rhodococcus erythropolis IGTS8，后重新分类为R. qingshengii）是首个被分离出的能够选择性裂解顽固有机硫化合物DBT中碳-硫键的菌株。它含有一个硫特异性代谢途径，即“4S途径”。该途径通过dszA、dszB和dszC基因产物在一系列氧化反应中催化，并在黄素单核苷酸（FMN）还原酶DszD的支持下，选择性地裂解DBT中的C–S键，将其转化为2-羟基联苯（2-HBP），而细菌则利用共产生的亚硫酸盐（SO₃^2-）。由于4S途径兼具选择性除硫、遗传可操作性和保持燃料热值的特点，它仍然是开发现实意义生物催化过程的关键工程系统。

一个受到严格调控的过程

BDS过程在天然菌株中受到严格调控，主要在转录水平上受易于利用的硫源可用性控制。在模型菌株R. qingshengii IGTS8中，由天然启动子P_dsz驱动的dszABC表达受到含硫氨基酸（如甲硫氨酸和半胱氨酸）以及特定培养基成分中无机硫酸盐的强烈抑制。这种抑制机制确保了这种耗能的4S途径仅在硫限制条件下被激活。相比之下，像DBT这样的有机硫化合物可以作为底物，在抑制解除后重塑同化硫代谢和氧化应激反应，将途径通量与全局硫稳态联系起来。此外，操纵子的内在结构也带来了额外的转录后控制；dszA和dszB之间的基因重叠导致的翻译耦合，使得催化途径限速步骤的DszB酶表达量降低。这种严格的转录抑制和低效翻译的结合，导致了天然生物催化剂常有的低催化活性，这是代谢工程和合成生物学试图克服的主要工业应用障碍。

优化生物催化剂

高效BDS生物催化剂的开发通过两种独立途径推进：一是通过基因工程改良天然BDS菌株；二是利用成熟的合成生物学底盘从头设计BDS菌株。

代谢工程方法——红球菌

优化红球菌用于BDS的核心策略是运用基因工程克服严格的天然调控。最成功且广泛采用的策略是启动子工程——具体而言，用强组成型（如P_kap1）或诱导型（如P_tipA）启动子替换天然可抑制的P_dsz启动子，以确保高水平的dsz表达。另一种方法是通过操作子重排（如改为dszBCA）和消除dszA与dszB之间的天然翻译耦合来平衡酶的表达水平。在此基础上，在原位进行启动子替换已在IGTS8中产生了不可抑制的dsz操纵子，使活性与硫可用性解耦，并通过避免质粒负担，在含硫培养基中提高了BDS性能。其他方法包括调整黄素还原酶DszD的表达以提供更多辅因子，或通过构建人工硫汇来加速BDS过程。

合成生物学方法——假单胞菌

早期研究证明了使用非天然启动子序列将dszABC基因簇从红球菌转移到假单胞菌的可行性。这种方法避免了基于硫的基因抑制，并证明革兰氏阴性菌宿主可以通过4S途径有效支持强脱硫活性。当前的假单胞菌工程方法将dszABC操纵子视为可定制的遗传模块进行性能优化：重排基因顺序（通常为B-C-A序列）、消除天然基因重叠、微调核糖体结合位点（RBS），并将基因整合到特定的染色体位置（如attTn7）。这些变化提高了遗传稳定性，减少了细胞代谢负担。在衍生的底盘菌中，这种基因重新设计与染色体整合的组合比使用高拷贝数质粒效果更好，并增强了细菌对2-HBP等应激诱导化合物的耐受性。互补的策略是将4S途径与能够降解2-HBP的宿主（如P. azelaica）配对，通过HbpCAD途径将2-HBP矿化，这大致能使DBT去除率翻倍，甚至允许以DBT作为碳源生长。

由于DBT类芳香族化合物存在于有机相中，假单胞菌天然的溶剂耐受性和外排功能维持了其在两相系统中相当比例溶剂下的活性，但在DBT浓度升高时会出现底物抑制；扩展的Haldane型模型捕捉了这些趋势，用于指导生长细胞和静息细胞的相比例和进料选择。专注于传质的研究量化了界面面积和有机相组成如何影响表观动力学——这些数据为乳化、溶剂选择和剪切策略提供了依据。

工艺考量

现代BDS以工艺为中心：除了酶/回路设计，成功还取决于溶剂丰富介质中的底物/O₂输送、2-HBP的缓解以及稳健的全细胞形式。在反应器规模上，搅拌罐、气泡塔和气升式生物反应器必须平衡氧传递与剪切/乳化；案例研究明确了这些权衡。工程层面的综述将生物表面活性剂/乳化剂、吸附/原位产物去除、溶剂管理等作为实际解决方案，以缩短2-HBP停留时间并缓解反馈抑制。操作杠杆也很重要，例如，向R. erythropolis KA2–5-1供给乙醇可提升还原当量供应。在真实燃油基质中，绝对速率会下降，因此BDS最好定位为温和HDS后的精制步骤，以针对难处理的残留硫化合物。值得注意的是，生物催化剂年龄和浓度、有机相比例以及硫化合物类型等参数在进行工艺优化时尤为重要。

迈向21世纪

尽管经过数十年研究，BDS的工业应用仍极其有限，这可归因于几个相互关联的非生物因素。首要原因是炼油行业固有的保守性，其利润微薄，倾向于选择具有成熟操作记录的技术，而非被认为风险更高的新型生物技术方法。不断改进的HDS催化剂，特别是在先进载体材料上开发高活性金属配方，逐步提高了BDS必须超越才能证明其采用价值的标准。此外，将生物反应器整合到现有炼油厂基础设施所需的大量资本投资，包括专门的分离单元、生物催化剂再生系统和产物回收设施，构成了重大的经济障碍。

然而，当前形势与十年前截然不同：全球日益严格的硫法规、加工更重且含硫更顽固的原油的需求、减少炼油操作碳足迹的压力增大，以及合成生物学和代谢工程的进步，共同重新激发了将BDS作为补充或替代脱硫策略的兴趣。

在此框架下，BDS已从途径发现转向结合分子设计与考虑传质的工艺开发的多尺度集成工程。尽管4S途径并非BDS的最终解决方案，但它无疑是当前知识基础最深厚的工程平台。经典的4S途径仍然是核心，但其实际速率不仅受Dsz酶动力学影响，同样受硫调控的基因表达和氧化还原供应调控。因此，现代的努力方向包括：在天然和异源（耐溶剂）宿主中解除调控、重新平衡辅因子以及重构操纵子。由于DBT类芳香族化合物存在于有机相中，且2-HBP等产物会抑制催化，当前策略通过静息细胞或固定化形式、生物膜、选择性溶剂、膜/气泡塔接触器和原位产物去除等技术，共同解决毒性和传质问题。这些结合了生物学和工艺的干预措施拓宽了底物范围（如烷基化DBT、苯并噻吩），并将表观动力学提升至炼厂相关的通量水平。并行的技术经济和生命周期评估现在将BDS定位为与HDS并列的混合工艺中的精制步骤，其中温和的HDS简化了硫化物种类，而BDS在温和条件下提供选择性精制。

展望未来，组学指导的建模和机器学习辅助的酶/回路设计有望压缩迭代周期，并揭示在规模上协调调控、传质和鲁棒性的非显而易见杠杆。下一步是果断超越模型DBT，转向真实馏分油的中试规模运行和混合HDS-BDS方案。进展将来自下一代生物催化剂（AI指导的4S酶/回路重新设计、更强的FMN/FAD供应、膜/外排调控），并可能来自将底盘扩展到红球菌/假单胞菌之外。设计的将4S专家与2-HBP矿化菌配对的联合体（最好共固定化），应能稳定界面、缩短产物停留时间，并在真实燃料的两相设计中提高生物催化剂的稳定性。在工艺方面，保持静息细胞与燃料持续接触并原位去除2-HBP的简单、连续设置将可靠地提高生产率。虽然4S途径仍然是选择性C-S键裂解最成熟和可工程化的途径，但仅优化4S途径最终可能因辅因子/氧化还原需求、2-HBP反馈抑制和两相传质限制而达到平台期。长期部署可能需要超越简单的4S酶优化，转向集成架构，例如将4S与2-HBP矿化支路耦合，和/或转向分配代谢负荷并稳定燃料-水界面的合成联合体。这些超越4S的设计对于在规模上协调辅因子供应、产物毒性和通量，或作为更绿色环境的解决方案至关重要。