eDNA宏条形码技术提供的生物多样性估计结果与传统采样方法相当

《Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences》：eDNA metabarcoding provides biodiversity estimates comparable to conventional sampling methods

　　摘要
有效估计鱼类群落组成的策略对于保护工作至关重要。虽然传统的样本采集方法可能有效，但环境DNA（eDNA）分析已成为一种潜在的替代方案。然而，系统地比较这些方法对于评估它们的相对有效性至关重要。我们从加拿大安大略省汉密尔顿附近的14个池塘中收集了水样，并使用两种通用宏条形码引物对鱼类eDNA进行了分析。这些池塘也使用传统的鱼类采样方法（电捕鱼和/或围网）进行了采样。随后，我们排空了一部分池塘以获取种群数量统计，从而便于对传统采样方法和eDNA采样方法之间的假阴性和阳性结果进行标准化比较。我们发现，在检测到的物种数量方面，两种采样方法之间没有显著差异，尽管eDNA在检测极低丰度的物种方面更为有效，但容易产生假阳性结果（即在排水过程中未捕获到鱼类个体时仍检测到鱼类eDNA）。我们估计，11个eDNA样本应该足以量化类似生态系统中的鱼类群落生物多样性。eDNA代表了传统方法的一个可行替代方案或补充方案，增强了其在水生生态系统管理中的潜力。

引言
自然生态系统目前正面临前所未有的由人类活动引起的压力，同时全球生物多样性也在下降（Irfan和Alatawi 2019）。全球的淡水生态系统受到了特别严重的影响，近年来淡水生态系统中的物种数量急剧减少（Reid等人2019）。加拿大也不例外，因为长期以来人们就认识到淡水鱼类种群容易受到人类活动的威胁（Post等人2002），有18.7%的物种被认为是“处于风险中”（Desforges等人2022）。随着全球水体越来越多地受到人类活动的影响，生物学家需要准确、最新的物种数量数据（Poesch等人2016；Duarte等人2020）。了解物种丰富度和丰度的变化或潜在入侵物种的引入情况，可以允许快速采取管理措施（Hillebrand等人2017）。传统上，生物学家依赖传统的调查技术来量化鱼类生物多样性，如指数网捕捞和电捕鱼。然而，这些技术具有物理侵入性，可能导致个体样本受伤或死亡。此外，传统技术可能存在显著的选择性；例如，网眼大小和其在水柱中的位置可能导致网对不同大小的物种具有选择性（Bayley和Herendeen 2000），而电捕鱼的电压对不同种类和大小的鱼类也有不同的影响（MacNaughton等人2014；Pottier等人2019）。传统的物理样本采集方法可能劳动密集且资源消耗大。在生物多样性危机的时代，需要生物监测数据来促进有效的管理和保护。

环境DNA（eDNA）分析作为一种快速且成本效益高的技术，已经出现，可以用来量化水生生态系统中的生物多样性，并且相比传统采样方法具有多个优势（Beng和Corlett 2020）。环境DNA宏条形码技术依赖于使用“通用”引物扩增生物体释放的体外DNA（Taberlet等人2012；Rees等人2014）。与传统方法相比，eDNA调查的一个主要优势是对低丰度物种的敏感性更高。先前的研究表明，eDNA能够全面检测整个水生群落的物种组成（Hanfling等人2016；Klymus等人2017；Hallam等人2021）。与传统采样方法相比，eDNA分析在难以采样和/或物种丰度较低的环境中特别有效（Hatzenbuhler等人2017；Rojahn等人2021），而这些环境是传统调查无法检测到的（Furlan等人2015；Xia等人2021）。除了描述群落组成外，eDNA分析还可以提供有关生态系统中物种相对丰度的一些信息（Rourke等人2022），尽管其有效性可能取决于所使用的技术（例如，qPCR与宏条形码）（Yates等人2021）。在这项研究中，我们通过实证比较了eDNA与几种依赖物理样本采集的传统技术在量化淡水鱼类生物多样性方面的有效性。我们使用基于eDNA和传统的调查方法，系统地采样了安大略省汉密尔顿的14个池塘，以：（i）确定eDNA宏条形码是否能产生与传统调查相似或更敏感的物种丰富度估计；（ii）评估使用eDNA有效量化鱼类群落丰富度所需的采样工作量，识别潜在的混淆生态变量；（iii）检查eDNA宏条形码数据是否反映了相对物种丰度。我们假设宏条形码将产生与传统调查相当或更敏感的物种丰富度估计，因为它可以检测到广泛的物种，包括难以捉摸的分类群。此外，我们假设检测到所有存在物种所需的样本数量将与池塘中鱼类物种的总数成比例（例如，使用较少样本时可能会错过稀有物种的可能性增加），以及池塘大小，因为较大的环境往往更加异质，如果不增加样本数量，错过稀有和隐秘物种的可能性会增加（Connor和McCoy 1979）。我们还假设宏条形码可以产生与通过传统采样技术获得的估计值正相关的相对鱼类丰度估计，因为先前的研究表明物种丰度/生物量与eDNA产生之间存在一致的正相关关系（Yates等人2019；Rourke等人2022）。

材料与方法
2021年和2022年，加拿大渔业和海洋部（DFO）的工作人员在汉密尔顿市的雨水池塘进行了初步的渔业调查，以确定鱼类物种的存在和相对丰度。在调查的池塘中，选择了14个进行更密集的采样，优先考虑鱼类组合更加多样的池塘（见图1了解池塘位置）。选定的池塘面积从0.013公顷到1.354公顷不等。这些池塘大多与其他水道或池塘分离，只有在极端高水位事件时才会形成连接。池塘137、127、92和27是显著的例外，这些池塘有流入其他水道的出口。所有调查行动都得到了安大略省、草原和北极动物护理委员会（OPA-ACC）的批准，协议编号为OPA-ACC-2022-40。

图1. 安大略省汉密尔顿所有雨水管理池塘的位置。每个池塘都标有其相应的ID编号和黄色星号。浅灰色区域表示开发区域。地图使用ArcGIS? Esri灰色底图创建。

对于传统采样，使用以下至少一种方法对池塘进行了调查：（i）电捕鱼或（ii）围网。每种池塘采用的采样方法基于池塘的特征，如可访问性、深度和导电性。对于电捕鱼和围网，在采样前都会部署一个阻挡网；然后在阻挡区域内完成调查。在阻挡区域内进行耗尽采样，并重复多次，直到观察到捕获的鱼类数量下降（Hilborn和Walters 1992），通常需要五到七次尝试。30分钟后重新采样，以使每个池塘从之前的采样干扰中恢复，如果发现新物种，则进行额外采样。此外，在阻挡区域外也进行了采样，以确定池塘中是否存在其他物种。捕获的鱼类被计数、称重、测量并目视鉴定到物种。

根据初步调查收集的信息，选择了六个池塘进行完全排水以确定总丰度，其中两个池塘在2021年和2022年都进行了排水（表S2）。选定的池塘代表了从高到低物种多样性的范围，具有不同的池塘大小（0.013公顷到1.354公顷）。池塘缓慢排水直至可以行走，然后使用围网和电捕鱼尽可能地移除所有鱼类。所有个体都被鉴定到物种，单独测量和称重，或者如果收集到某一物种的个体超过100个，则按大小类别批量测量和称重。

为了对每个池塘进行eDNA调查，我们采用了一种系统化的调查设计，其中池塘内的采样点基于覆盖在每个池塘上的网格图案的交点选择。每个池塘的网格线之间的距离至少为10米，以确保每个点代表一个独特的样本，因为eDNA在静水系统中的分布/传输从其源头开始呈指数级减少（Ghosal等人2018；Goldberg等人2018）。对于较大的池塘，点之间的距离增加，以便采样的总站点数量约为20个，这样样本可以覆盖整个池塘区域，同时产生的eDNA样本数量在物流上可行。每个池塘收集的站点数量范围从5到23个不等。2021年6月，在3个池塘中进行了eDNA采样，共收集了31个样本。2022年5月至8月期间，在13个池塘中进行了采样，共收集了203个样本（表S1）。部分池塘在两个季节和两年中都进行了采样（池塘89和104）。eDNA采样在传统采样之前进行，以确保沉积物中捕获的任何DNA不会被搅动并可能影响eDNA结果。

在每次采样之前和之后，所有采样和存储设备都用10%的漂白剂溶液消毒，并在去离子水浴中冲洗两次以去除残留的漂白剂。现场阴性对照包括500毫升蒸馏水，用于验证消毒协议的成功，并在池塘采样开始时以及每从池塘收集5个水样后收集。

在水面采样点，从近岸（<2米远离岸边）和离岸（>2米远离岸边）区域收集水样。对于近岸区域，使用带有500毫升Nalgene瓶的杆式采样器收集水样。对于离岸区域，我们使用配备500毫升取样瓶的无人机。无人机在目标地点上空悬停，同时从池塘表面取样。每个地点总共收集了两升水，使用了四个500毫升的Nalgene瓶，然后在去污塑料盆中混合均匀后过滤。每个地点的三个500毫升混合水样通过1.5微米、47毫米的Whatman玻璃微纤维过滤器在-60千帕的压力下过滤。过滤后，使用一次性塑料镊子将玻璃纤维过滤器放入含有Dry&Dry干燥剂的塑料袋中的硬币信封中。如果干燥剂珠子完全饱和，则更换新的干燥剂珠子以完成干燥过程。袋子被标记并放入装有冰块的冷却器中直到当天结束，之后转移到-20°C的冷冻柜中直至提取。

环境DNA提取和测序
DNA提取在温莎大学大湖环境研究所的eDNA提取实验室的专用通风橱中进行；该实验室专门用于处理eDNA样本，不允许处理高浓度DNA（例如组织提取或PCR后的产物）。所有表面在每天之前和之后以及提取过程中必要时都用至少10%的漂白剂溶液消毒，并用RNase AWAYTM擦拭。通风橱中的紫外线灯每天之前和之后对工作区进行20分钟的消毒。用于处理多个样本的所有设备（镊子、剪刀）在每次样本之间用10%的漂白剂溶液浸泡至少10分钟，然后用两次连续的蒸馏水冲洗以去除残留的漂白剂。eDNA提取使用Qiagen Investigator Lyse&Spin Baskets和Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒进行，遵循修改后的协议（DFO Protocol 001，补充材料S1）。DNA洗脱至最终体积200微升。

为了确保PCR阶段的DNA扩增并检测污染，分别提取了阳性和阴性实验室对照。阳性对照使用牛肉组织浆液（5微升）（补充材料S2），阴性对照由200微升超纯水组成，滴加到与现场样本收集相同的玻璃微纤维过滤器上。两种对照样本都经过了提取、扩增和测序，所使用的过程与eDNA样本相同。为了提高分类学覆盖率和分辨率，我们使用了两组 metabarcoding 引物（M-Mito 和 PS1）。M-Mito 引物针对线粒体 12S 基因，而 PS1 引物针对线粒体 CO1（细胞色素 c 氧化酶亚基 I）基因。M-Mito 引物产生的目标扩增子长度约为 315 个碱基对，PS1 引物产生的目标扩增子长度约为 247 个碱基对。需要注意的是，这些引物组包含用于在后续条形码 PCR 步骤中添加 5′ Uni-A 和 Uni-B 引物的适配器。PS1 引物之前已被用于评估安大略省南部系统的鱼类生物多样性（详见 Balasingham (2016) 和 Balasingham 等人 (2017) 的研究及引物序列）。M-Mito 引物组是作为 GENFISH 项目（https://gen-fish.ca）的一部分开发的，旨在生成更长的扩增子 metabarcoding 标记。M-Mito 引物组特异性地扩增了 MiFish (Mia 等人, 2015) 和 Riaz 12S (Valentini 等人, 2016) 引物组所针对的区域，使用的序列如下：M-Mito-F 5′-ACCTGCCTGCCGGGTAAAACTCGTGCCAGC-3′；M-Mito-R 5′-ACGCCACCGAGCTAGAACAGGCTCCTCTAGG-3′（Yates 等人, 2025）。

第一轮 PCR 使用 M-Mito 和 PS1 引物扩增从池塘样本中提取的鱼类 DNA。每次 PCR 反应包含：2.5 μL 10X PCR 缓冲液、3.5 μL MgSO4、1 μL 10 μm M-Mito-F、1 μL 10 μm M-Mito-R、0.5 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.1 μL Biobasic Taq 聚合酶和 14.4 μL 超纯水，以及 2 μL 提取的 eDNA 模板。两种标记物的两步 PCR 循环条件包括一个初始变性步骤（95°C 2:30 分钟），随后是 35 个循环，每个循环 30 秒在 95°C，以及一个退火步骤（M-Mito 为 58°C，PS1 为 52°C）。样本随后在 4°C 下保存，直到被存入 -20°C 的冷冻柜中。通过凝胶电泳确认了成功的 PCR 扩增。

剩余的 PCR 产物通过 SPRI (Sera Mag) 珠子协议进行清洗（补充材料 S3），清洗后的 PCR 扩增 DNA 经过第二轮 PCR，以在各个孔中的片段上添加唯一的序列 ID（条形码）。PCR 主混合液每次包含：2.5 μL 10X PCR 缓冲液、3.5 μL MgSO4、0.5 μL UniB 引物、0.5 μL UniA 引物、0.5 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.1 μL Biobasic Taq 聚合酶、7.4 μL 超纯水和 10 μL DNA 模板（经珠子清洗的 PCR 产物）。两种标记物的两步 PCR 循环条件包括一个初始变性步骤（95°C 2:30 分钟），随后是 8 个循环，每个循环 30 秒在 95°C，以及一个退火步骤（两种引物均为 55°C）。样本随后在 4°C 下保存，直到被存入 -20°C 的冷冻柜中。

然后，将样本在 2% 琼脂糖凝胶上进行成像，以确认样本的扩增情况并确定用于文库制备的材料量。根据条带的亮度，给每个样本分配 1-5 的值，其中 1 表示最亮，5 表示不可见。样本随后被合并到一个文库中，每个样本的合并 PCR 产物量根据上一步分配的值确定，该数值对应于合并到文库中的产物体积（以 μL 为单位）。合并文库后，通过凝胶电泳将目标 DNA 片段与较小的 DNA 片段（引物、引物二聚体等）分离，然后从凝胶中切割并提取目标扩增子大小的 DNA。

使用 GenCatchTM 凝胶提取试剂盒并按照制造商的协议，我们将提取的 DNA 洗脱到 15 μL 的洗脱缓冲液中。随后，在温莎大学环境基因组学设施的 ThermoFisher Ion GeneStudio S5 Next-Gen 测序仪和 Ion Torrent Chef 上对文库进行测序，之前先进行了文库标准化处理。

为了确定群落组成，首先通过修剪引物、去除低质量读段和嵌合序列来清洗原始读段数据。数据清洗步骤在 QIIME 2（版本 2024.2）中使用 cutadapt 程序（Martin 2011）分离序列与引物，并使用 dada2 程序（Callahan 等人, 2016）进行序列清洗/去噪。清洗参数如下：PS1 – 190 bp 截断长度，质量分数 2；M-Mito – 290 bp 截断长度，质量分数 2。相似度百分比设置为 97%。这些截断长度是根据碱基对位置的平均质量分数曲线确定的。最终读段使用所有安大略省淡水鱼类的参考序列集进行分类。加拿大鱼类的参考 DNA 序列数据库通过 GENFISH 从 NCBI 获取，并参考了组织样本。

由于 eDNA 的敏感性，需要尽量减少假阳性和假阴性的数量，以提供最准确的物种数量估计（Evans 等人, 2017a）。我们首先将每个样本中被认为是“阳性”检测到的 eDNA 序列读段的最小数量设置为两个，以便能够检测到稀有或隐秘的物种（Zhan 等人, 2014；Goldberg 等人, 2016；Balasingham 等人, 2017）。

为了进一步过滤 eDNA 读段，我们采用了从先前发表的 metabarcoding 研究中修改的严格性参数（Evans 等人, 2017a）。我们选择了两个严格性级别：低严格性和高严格性。“低”严格性级别认为在某个池塘中的任何物种，如果在任一组引物上有 ≥2 个读段，则视为阳性检测。“高”严格性级别仅认为在至少一个池塘中的两个标记物上都有 ≥10 个读段的物种才视为阳性检测。

首先，我们试图确定使用 eDNA metabarcoding 和传统采样方法检测到的物种的存在与否之间是否存在关系。为了确定任何方法的检测是否为假阳性/假阴性，我们将分析限制在完全排干的池塘子集上，假设这种方法不会产生假阳性或假阴性。在这里，我们将假阴性定义为尽管在排干池塘期间捕获了一个或多个该物种的个体，但在所有收集的样本中都没有检测到该物种的 eDNA。此外，我们将假阳性定义为假站点级别的检测（Darling 等人, 2021）——即在一个或多个 eDNA 样本中检测到某个物种的 eDNA，尽管在排干池塘期间没有捕获到该物种。与大多数将鱼类 eDNA 研究与传统采样结合的研究不同，排干池塘后收集的总普查数据有助于明确区分假阳性站点级别检测和假阴性检测。虽然非常稀有和体型较小的物种可能在排干后从池塘中遗漏，或者有短暂的个体进入和离开这些池塘系统，但我们认为这种情况不太可能发生。然而，在调查的 14 个池塘中，只有 6 个池塘（池塘 89、104、105、106、124 和 127）被排干（总共 7 次排干事件），因为完成每次调查需要付出大量努力，因此我们仅将“假阳性”的分析限制在排干的池塘上，因为我们无法区分真正的站点级别 eDNA 假阳性和传统采样的真正站点级别假阴性。

首先，对于每种采样方法（eDNA、电捕鱼和围网），我们统计了排干池塘后完全种群普查中假阳性和/或假阴性检测到的物种数量。假阳性被定义为任何方法在排干池塘后未观察到的物种的阳性检测。由于电捕鱼或围网捕鱼需要物理捕获样本，因此假阳性极不可能发生，它们只可能由于物种识别错误而发生。假阴性发生在排干后检测到的物种未被一种或多种其他采样方法检测到时。

然后，我们统计比较了所有方法（包括完整的种群普查）在排干池塘中的敏感性。我们使用一般线性混合效应模型对每个池塘中每种采样方法检测到的物种数量进行了建模，以确定不同采样类型之间是否存在显著差异。假设物种数量服从泊松分布，将检测到的物种数量作为因变量。“采样方法”作为固定分类变量，包括围网、电捕鱼和排干的因子水平，以及基于“严格性”标准的两种 eDNA 结果。每个池塘采样事件（即，将池塘采样两次视为独立的采样事件）作为随机效应，以解释不同采样方法得出的重复估计之间的相关性（即伪重复）。所有分析都在 R 版本 4.3.2（R Core Team 2024）中使用 lme4 包（Bates 等人, 2015）进行，使用 emmeans 包（Lenth 2024）进行固定效应水平之间的成对比较。在校正假发现率（FDR）后，确定了每个成对比较的显著性。

为了检查我们的数据是否提供了假阳性“背景率”的证据（Darling 等人, 2021），我们还检查了从池塘收集的样本数量与检测到的假阳性数量之间是否存在正相关关系。如果存在“背景”假阳性率，我们预计随着样本数量的增加，假阳性检测的数量也会增加。为了评估这种关系，我们使用具有泊松分布的一般线性模型，将假阳性检测作为因变量。从池塘收集的样本数量作为连续固定效应，模型选择如上所述进行。我们注意到，这项分析也仅限于排干的池塘，并且针对高严格性和低严格性的 eDNA 检测数据进行了分析。

最后，我们还检查了考虑现场和/或实验室污染对假阳性/阴性率的影响，通过移除相应对照样本中发现的读段（Drake 等人, 2022）。在给定的池塘中，每种物种在野外阴性对照和实验室提取对照中检测到的最高 DNA 读段数量被加倍（以保守起见），然后从每个相应的现场样本中减去这个值。

为了比较不同方法在没有排干数据的池塘中的敏感性，进行了第二次分析，排除了排干后的数据，即使用 eDNA、围网和电捕鱼检测到的物种数量在所有 14 个池塘（16 次采样事件）中进行了比较。在这项分析中保留了最终排干的池塘的传统采样数据。模型结构和分析如上所述，不同之处在于“采样方法”固定效应变量中排干被排除作为因素水平。

然后，我们评估了方法在检测到的独特物种方面的系统差异（例如，物种是否仅由单一方法检测到）。排干后，没有一个池塘包含其他三种采样方法尚未检测到的物种，因此排干池塘以检测物种的方法被排除在后续分析之外。检测到的独特物种数量作为因变量，并使用假设泊松分布的广义线性混合效应模型进行分析。捕获方法作为固定分类变量，包括围网、电捕鱼和基于两种“严格性”标准的 eDNA 的因子水平。如上所述，池塘作为随机效应，以解释不同采样方法之间的伪重复。所有分析都在 R 版本 4.3.2（R Core Team 2024）中使用 lme4 包（Bates 等人, 2015）进行，使用 emmeans 包（Lenth 2024）进行固定效应水平之间的成对比较。

除了评估 eDNA 检测环境中存在的单个物种的有效性外，我们还评估了 eDNA 量化群落生物多样性指标的有效性，例如 Shannon 多样性。对于每个调查的池塘，我们首先使用 R 包 vegan（Oksanen 等人, 2020）量化了用于检测鱼类物种的任何方法（eDNA、排干、电捕鱼和围网）的 Shannon 多样性。我们随后将香农多样性作为因变量建立在线性混合效应模型中，方法（eDNA、排水、电捕鱼和围网捕鱼）被作为分类固定效应纳入模型，而池塘则作为随机效应。术语显著性通过F检验进行评估，分母的自由度使用Kuznetsova等人（2017年）的lmerTest包中的Kenward–Roger方法估算得出。

为了确定量化研究池塘中鱼类群落丰富度所需的最小eDNA样本数量，我们进行了功效分析。首先，我们根据每个池塘中每个严格性水平下的存在/缺失数据，使用Chao 2多样性估计方法进行了估算（Chao等人，2009年）。Chao 2公式用于估计给定社区的物种丰富度，即使并非所有物种都被检测到时也可以应用，因为它基于样本点上的物种出现模式来估计未检测到的可能性（Chao等人，2009年）。这些估算是在 EstimateS 9.1.0（Colwell，2013年）中完成的。模拟运行了100次，使用了校正偏差的Chao 2公式。 EstimateS数据以负回归散点图的形式为每个池塘绘制。

然后，我们根据Evans等人（2017a）的方法，估算了在每个池塘内估计鱼类丰富度所需的采样工作量。我们定义了两个采样阈值来估算丰富度：（i）Chao 2估算曲线趋于稳定的样本数量（定义为估算值相对增加<2%）；或者（ii）如果曲线未能根据此阈值趋于稳定，我们计算出检测到池塘中95%物种所需的样本数量（向上取整）。接着，我们使用一般线性混合效应模型分析了Chao 2采样阈值，将达到采样阈值所需的样本数量作为因变量，并假设其服从泊松分布。虽然尝试使用负二项分布来建模因变量，但模型未能收敛。传统调查检测到的物种总数、池塘面积（以公顷计）和池塘温度被作为连续固定效应纳入模型，而严格性标准（高/低）被作为分类固定效应。所有分析均在R版本4.3.2中使用lme4包（Bates等人，2015年）进行。术语显著性通过使用似然比检验（LRTs）的逐步回归模型选择方法进行评估。固定效应因子水平之间的成对比较使用emmeans包（Lenth，2024年）进行。

基于上述最终模型，我们估算了在“高严格性”eDNA严格性类别下（最保守的严格性水平）估算池塘中鱼类丰富度所需的平均样本数量。然后，我们通过从泊松分布中自助抽样10,000次来确定估算池塘中物种丰富度所需的样本数量的预测区间，该分布的均值等于上述估算值。通过估算模拟分布的50%、75%和95%的分位数，确定了确定所有存在物种所需样本数量的估算。

我们探讨了系统性eDNA宏条形码调查评估这些生态系统中鱼类物种相对丰度的能力。通过将每个物种的读取丰度和CPUE分别除以总读取丰度和CPUE，计算了每个池塘中每个物种的相对读取丰度和相对渔业CPUE。每个标记的相对读取丰度是独立估算和分析的（即，PS1和M-Mito的物种读取丰度分别进行分析），仅使用“高严格性”数据。相对读取丰度作为因变量，使用假设贝塔分布的广义线性混合效应模型进行分析。相对CPUE作为连续固定效应纳入模型，捕获方法（电捕鱼 vs. 围网捕鱼）作为分类固定效应，并添加了相对CPUE和捕获方法之间的交互项。所有模型中都包含了物种和池塘作为交叉随机效应，以考虑伪重复。所有分析均在R版本4.3.2中使用lme4包（Bates等人，2015年）进行。术语显著性通过使用LRTs的逐步回归模型选择方法进行评估。固定效应因子水平之间的成对比较使用emmeans包（Lenth，2024年）进行。

根据上述最终模型，我们估算了在“高严格性”eDNA严格性类别下估算池塘中鱼类丰富度所需的平均样本数量。然后，我们通过从均值为上述估算值的泊松分布中自助抽样10,000次，确定了估算池塘中物种丰富度所需样本数量的预测区间。

我们探讨了系统性eDNA宏条形码调查评估这些生态系统中鱼类物种相对丰度的能力。通过将每个物种的读取丰度和CPUE分别除以总读取丰度和CPUE，计算了每个池塘中每个物种的相对读取丰度和相对渔业CPUE。每个标记的相对读取丰度是独立估算和分析的（即，PS1和M-Mito的物种读取丰度分别进行分析），仅使用“高严格性”数据。相对读取丰度作为因变量，使用假设贝塔分布的广义线性混合效应模型进行分析。相对CPUE作为连续固定效应纳入模型，捕获方法（电捕鱼 vs. 围网捕鱼）作为分类固定效应，并添加了相对CPUE和捕获方法之间的交互项。所有模型中都包含了物种和池塘作为交叉随机效应。所有固定效应项的显著性通过使用LRTs的逐步选择方法进行评估，首先测试高阶项（例如，交互项）。模型拟合度使用Efron的伪R2（Laitila，1993年）进行评估，该指标估计了模型预测与观测数据之间的相关性。

在14个调查池塘中，通过电捕鱼、围网捕鱼和排水，在16次采样事件中识别出21个物种。不同池塘的独特物种丰富度从1到9种不等（表1）。在所有池塘中，通过电捕鱼检测到15种不同物种，通过围网捕鱼检测到15种物种，通过完全种群普查（排水后）检测到12种物种。

测序产生了74,895,071个读取（28,188,955个M-Mito和46,706,116个PS1读取），涵盖了所有271个样本（包括现场和实验室对照样本）。去噪后，剩余48,859,649个读取（10,739,130个M-Mito和38,277,959个PS1读取）。未分配的读取——即无法识别或不在参考库中的物种——总计35,493,892个（936,642个M-Mito和34,808,178个PS1读取）。总共，13,272,279个读取（9,802,488个M-Mito和3,469,781个PS1读取）被分配了独特的物种标识。环境DNA在所有16次采样事件中检测到22种不同物种，电捕鱼在8次采样事件中检测到15种不同物种，围网捕鱼在12次采样事件中检测到15种不同物种。在七次池塘排水事件后的完全种群普查中发现了12种不同物种。

在分析的72个现场阴性对照样本中，我们发现至少有一种鱼类在低严格性条件下被检测到31次。在这31次检测中，有19次也在高严格性条件下被检测到。对于后者，六个阴性对照样本中含有大量eDNA读取（>100），这些物种存在于产生相应阴性对照的池塘中，表明可能存在来自同一环境的样本污染。实验室阴性对照在低严格性条件下检测到15种物种，其中8种也在高严格性条件下被检测到。其中两个样本中含有大量eDNA读取（>100），这些物种存在于与相应阴性对照相关的池塘中。总体而言，在75.0%的采样池塘的现场对照样本中观察到污染；在68.8%的所有DNA提取和文库对照样本中观察到污染；在56.0%的现场和实验室对照样本中观察到污染。

正如预期的那样，增加数据过滤的严格性导致eDNA检测到的物种数量减少（表1）。在所有采样池塘中，低严格性条件下，有44次使用eDNA宏条形码检测到物种，但使用传统方法或在排水后的完全种群普查中未检测到；在高严格性条件下，这一数字减少到20次（表1）。仅比较排水后的池塘子集时，我们发现传统调查方法产生了一个假阳性（池塘124中的一个白吸盘鱼个体），而eDNA在低严格性和高严格性条件下分别产生了20个和8个假阳性（表S2）。每个池塘的平均eDNA假阳性数量分别为1.25和0.50。每个eDNA样本的平均假阳性率为低严格性下的0.0855和高严格性下的0.0342。我们没有发现证据支持收集的样本数量与使用低严格性标准处理的eDNA数据的假阳性检测数量之间存在关系（χ2 = 0.19，p = 0.662），但在高严格性标准下有边际支持（χ2 = 3.01，p = 0.082）（图S1）。然而，需要注意的是，这项分析受到六个排水池塘样本量的限制。此外，通过使用基于阴性对照中序列读取的动态阈值来过滤序列读取，成功消除了两个在高严格性条件下未被排除的假阳性。这些包括池塘106中的金鱼假阳性（在低严格性下检测到）以及池塘124中的绿太阳鱼假阳性。

相反，eDNA在假阴性方面表现优于传统方法。低严格性eDNA方法未检测到一种物种，高严格性方法漏检了两种物种，电捕鱼漏检了三种物种，围网捕鱼漏检了四种物种，相对于排水后的完全普查。每种“漏检”的物种都是特定于池塘的；例如，虽然高严格性eDNA方法在池塘105中未检测到金鱼，但在其他池塘中检测到了这种物种。两种白鲈鱼（Morone americana）既未被传统方法也未被eDNA检测到，而eDNA唯一漏检的物种是一条金鱼（表S3）。每个池塘的平均假阴性数量分别为低严格性下的0.0625和高严格性下的0.125。每个样本的平均假阴性数量分别为低严格性下的0.00427和高严格性下的0.00855。对于传统方法，每个池塘的平均假阴性数量分别为电捕鱼的0.189和围网捕鱼的0.250。每个样本的平均假阴性数量分别为电捕鱼的0.013和围网捕鱼的0.017。在所有采样方法（eDNA、围网捕鱼和电捕鱼）中，每个假阴性都只与完全普查中恢复的一个或两个个体相关（即，所有假阴性涉及的物种都非常稀少）。值得注意的是，根据对照样本中检测到的污染情况纠正样本检测并未导致假阴性数量增加。

在完全普查池塘中检测到的物种总数显著受到检测方法的影响（χ2 = 12.97，p = 0.011）。然而，尽管低严格性eDNA倾向于“检测”（包括假阳性检测）更多物种，但在调整了假发现率后，没有一种方法与其他方法有显著差异，这可能是由于样本量小导致的统计功效低（图2a）。

图2. 比较了各种方法在调查池塘中检测到的平均物种数量：(A) 所有池塘中通过方法检测到的总物种数量（包括排水数据）的平均值（±标准差）。(B) 排除排水池塘的完全普查数据后，所有池塘中检测到的总物种数量的平均值（±标准差）。A和B中的统计显著性通过假发现率建模确定。具有相同字母的处理方法在成对比较中无显著差异（p < 0.05）。eDNA、环境DNA。

在比较所有研究池塘中的eDNA、电捕鱼和围网捕鱼时，无论数据是通过排水后生成的，我们发现传统方法检测到的物种有九种未被eDNA检测到。此外，我们观察到44次情况，即一种物种被eDNA检测到，但未被电捕鱼或围网捕鱼在低严格性条件下检测到，其中20次也在高严格性条件下发生。有53次情况，一种物种同时被eDNA和至少一种传统方法检测到。在这53次检测中，有51次是在“高”严格性水平下检测到的（表1）。总体而言，高严格性下识别的物种数量与传统采样的观察结果最为一致（表1）。

比较所有池塘中的方法时，检测方法对检测到的物种数量有显著影响（即，排除排水后的数据）（χ2= 15.43，p = 0.001；图2b）。经过FDR校正后，低严格性eDNA的检测率显著高于围网捕鱼（t = 1.92，p = 0.007），略高于电捕鱼（t = 2.24，p = 0.096）；高严格性eDNA的检测率略高于围网捕鱼（t = 2.03，p = 0.096），略低于低严格性eDNA（t = 1.92，p = 0.096）。传统方法之间的检测数量没有显著差异（电捕鱼和围网捕鱼）。

检测方法对检测到的独特物种数量有显著影响（χ2= 36.74，p < 0.001）。不出所料，低严格性eDNA检测到的独特物种数量更多（平均= 2.3）（高严格性eDNA平均= 1.1）（图3）。电捕鱼和围网捕鱼检测到的独特物种数量较少（平均分别为0.5和0.43）（图3）。低严格性eDNA检测到的独特物种数量显著高于围网捕鱼（t = 4.08，p = 0.002）和电捕鱼（t = 3.37，p = 0.008）。高严格性eDNA检测到的独特物种数量显著低于低严格性eDNA，并显著高于围网捕鱼（t = ?2.83，p = 0.017；t = 2.51，p = 0.028）。所有其他的成对比较在统计上没有显著差异（图3）。图3。图3。通过不同方法在所有池塘中检测到的独特物种的平均数量（±标准差）。具有相同字母的处理在成对比较中没有显著差异（p < 0.05）。eDNA，环境DNA。量化群落生物多样性的指标方法对研究池塘中香农多样性的估计没有显著影响（??323.3 = 1.65，p = 0.204），表明传统方法和eDNA产生的生物多样性估计值相似。所有研究池塘的平均香农多样性为0.52（标准误 = 0.11）。确定量化鱼类丰富度所需的最小eDNA样本数量在初始的Chao2广义线性混合模型中，没有任何项是显著的。最终模型仅包含一个截距和池塘的随机效应。最终模型估计出量化物种丰富度所需样本的平均数量为6.34个。因此，我们估计6个样本足以检测到50%的池塘中的所有物种，9个样本可以检测到85%的池塘中的所有物种，而11个样本则可以检测到95%的池塘中的所有物种。eDNA宏条形码读取与相对物种丰度之间的关系相对丰度和相对eDNA之间的关系在两种标记物之间表现出相似性。对于M-Mito标记物，相对CPUE与捕获方法之间的交互作用是边缘显著的，并从模型中剔除（p = 0.052）。捕获方法不显著（p = 0.910）。相对CPUE对相对读取计数有显著影响（χ2 = 68.54，df = 1，p < 0.001）。对于PS1标记物，交互项不显著（p = 0.068），并从模型中剔除。捕获方法也不显著（p = 0.332），也被剔除。最终模型中唯一显著的项是在去除捕获方法项之前和之后的相对CPUE（χ2 = 36.05，p < 0.001）。相对CPUE在两个模型中都显著，表明相对CPUE与任何物种的相对eDNA读取数量相关（M-Mito Efron的伪R2 = 0.601；PS1 Efron的伪R2 = 0.402；图4）。图4。图4。基于传统采样的相对eDNA宏条形码读取与相对CPUE之间的关系，以及拟合的预测模型线。M-Mito（A面板）Efron的伪R2 = 0.601。PS1（B面板）Efron的伪R2 = 0.451。讨论宏条形码作为一种有效的方法，可以用来检测物种的存在，与传统的采样技术相比（Zhan等人2014；Shaw等人2016）。然而，采用或接受eDNA进行生物多样性调查的一个典型问题是缺乏“实际捕获的鱼类”来确认eDNA的阳性检测结果。作为一种间接检测方法，eDNA不依赖于样本的物理捕获，这常常导致潜在采用者之间的不确定性（Jerde 2019；Sepulveda等人2020）。我们的研究直接解决了这个问题：几乎一半的调查池塘随后被排干用于常规维护，从而能够完全统计池塘中存在的所有鱼类。先前的研究已经比较了传统采样方法和eDNA调查在灵敏度和丰度估计方面的差异（Hanfling等人2016；Lawson Handley等人2019；Sard等人2019；Gehri等人2021）。然而，传统方法通过物理捕获生态系统中的个体来估计生物多样性，容易受到方法特定偏差的影响（Di Muri等人2020）。因此，传统采样方法容易产生假阴性结果，特别是对于稀有或难以捕获的物种。因此，通过eDNA阳性检测到的物种往往难以使用物理捕获方法进行验证，特别是当该物种的丰度较低时。通过排干我们研究的一部分池塘，我们能够确定eDNA和传统采样方法在几乎一半的调查池塘中的假阳性和假阴性检测率。迄今为止，只有另一项研究通过排干三个池塘提供了类似的绝对丰度估计（Di Muri等人2020）。我们的研究通过扩大调查生态系统的数量，并在排干之前将eDNA采样与传统的渔业调查方法（电捕鱼和围网）相结合，来实证评估它们的有效性。通过同时结合高通量测序eDNA和依赖物理样本收集的传统调查方法，我们能够实证证明eDNA采样在小型静水生态系统中产生的生物多样性估计值是可比的。我们的发现强调了使用eDNA进行物种检测需要在限制假阳性和假阴性之间取得微妙的平衡。在两种标记物中，eDNA在检测物种方面往往比传统方法更有效，与数据完整的普查数据相比，假阴性检测较少。特别是，传统采样遗漏的所有物种往往相对稀有（在排干的池塘中只有1到2个个体），这加强了eDNA在检测稀有物种方面的有效性及其相对于物理捕获方法的优势。eDNA还倾向于检测到更多的独特物种，显示出其更全面恢复实际鱼类生物多样性的能力。尽管eDNA能够检测到低丰度的物种，但排干进行全面普查的池塘显示，与传统采样相比，eDNA的假阳性检测更多，特别是在降低了读取过滤严格性的处理中。使用eDNA在排干的池塘中检测到的大多数假阳性物种根据物种的生态学和当地物种组合可能是真实的检测（例如，溪流刺鱼（Culaea inconstans）、溪流鲦鱼（Semotilus atromaculatus）、胖头鲦鱼（Pimephales promelas）和绿太阳鱼（Lepomis cyanellus））。如果没有在池塘排干后获得的完整普查数据，这些物种将仅基于在eDNA样本中的检测结果而被认为存在于研究系统中。因此，我们确定过滤标准是分析eDNA的重要组成部分。降低“真实”检测的严格性可能会检测到更多的物种，其中一些可能是由于假阳性检测。值得注意的是，当提高eDNA的严格性时，例如通过丢弃低读取量检测，所有调查池塘中检测到的“独特”物种的数量大大减少。提高eDNA结果的严格性将排干池塘的假阳性发生率降低了超过一半（从20个减少到8个）。同样，我们的结果支持了控制现场和实验室控制中的污染（即，通过从相应样本中减去控制样本中的读取量）可以帮助控制假阳性率（Drake等人2022）的观点。使用排干池塘的完整普查结果，我们确定低严格性eDNA检测到的独特物种数量较多可能是由于假阳性造成的，因为高严格性eDNA检测到的独特物种较少。例如，从高严格性结果中排除的几个物种，如粗头鱼（Gymnocephalus cernua），根据传统调查结果，这些物种预计不会自然出现在这些生态系统中。在所有调查的池塘中，高严格性eDNA数据与传统采样结果更为一致，尽管它们仍然倾向于检测到更多的独特物种。提高eDNA读取解释的严格性在假阳性和假阴性之间产生了权衡。我们观察到，提高eDNA解释的严格性仅导致我们的完整普查池塘中的假阴性略微增加（从1个增加到2个），同时显著减少了假阳性。因此，我们的发现强调了在解释eDNA检测数据时，eDNA的严格性至关重要（Evans等人2017a；Harper等人2018；Peixoto等人2020）。我们的结果还强调了防止潜在污染对eDNA采样的重要性。实验室和现场控制表明，一些假阳性检测可能是由于现场（例如，采样设备）或实验室（例如，样本处理）的污染造成的。然而，许多假阳性物种的DNA在两组控制中都没有被检测到。因此，一些站点级别的“假阳性”可能是真实的检测，但eDNA来源于现场以外的来源（例如，异源eDNA）（Carim等人2020）。大多数但不是所有的（例如，粗头鱼）假阳性物种通常出现在该地区的小型静水系统中。例如，沉积物可能是eDNA的来源，因为其在该环境介质中的降解速率较低（Turner等人2015）。采样过程中对沉积物的干扰可能允许收集历史上存在于池塘中的物种的eDNA。一些调查的池塘并不是完全封闭的系统（池塘137、127、92和27），eDNA和/或鱼类的对流传输可能是导致一些假阳性的原因（Pont等人2018）。然而，有出口的池塘与没有出口的池塘在假阳性数量上没有差异，池塘127和27各显示了5个假阳性，而池塘137和92各只显示了一个假阳性观察。然而，出口的大小和结构可能会影响鱼类进入和离开调查池塘的能力。我们的电捕鱼结果显示，在池塘124中检测到了一个“假阳性”的白吸盘鱼，这与排干后的数据相符。鉴于传统采样的“实际捕获”性质，这个检测显然不是一个真正的假阳性——白吸盘鱼在排干之前就存在于池塘中。我们怀疑池塘124中观察到的假阳性是由于在传统调查和随后的排干之间有白吸盘鱼离开了池塘。我们观察到这个假阳性表明，即使对于传统采样，由于采样与验证（即普查）之间的时间延迟，也预期会有低水平的假阳性。环境DNA可能相对于我们的验证数据有一个“真实”的假阳性背景率，在此期间，短暂存在的物种可能会被检测到，然后在这些验证之前离开系统。如果没有关于出口性质的进一步数据（平均排放率、连接水道中的鱼类群落等），就很难进一步推测它们对eDNA物种检测的影响。总的来说，我们的发现加强了eDNA宏条形码作为描述鱼类群落组成和生物多样性的有效方法的实用性（Evans等人2017a；Lawson Handley等人2019；Di Muri等人2020），特别是考虑到所有方法在研究池塘中的鱼类物种之间产生了相似的香农多样性估计值。eDNA调查可能特别适合确定稀有、敏感和/或濒危物种的存在，这些物种可能容易受伤或难以使用传统方法捕获，因为它们的数量少、避免使用捕捞工具或存在于偏远或难以采样的环境中（Ruppert等人2019；Bernos等人2023）。然而，我们发现传统采样技术在检测常见物种方面与eDNA具有相似的有效性。因此，eDNA的应用将取决于调查的目标（例如，检测非常稀有的物种与总体生物多样性估计）以及eDNA与传统物理样本方法相比的相对成本效益（Evans等人2017b）。劳动力和消耗品成本通常与收集的样本数量大致成线性比例。估计完全量化鱼类丰富度所需的最优样本数量是将eDNA采样整合到更广泛的生物监测计划中的重要步骤。我们发现，每个池塘六个eDNA样本足以量化一半研究池塘中的鱼类丰富度。通过从量化总鱼类丰富度所需的采样工作分布中推断，我们可以推断11个样本应该足以在95%的类似池塘生态系统中量化总鱼类丰富度（基于之前定义的阈值）。然而，我们没有发现证据支持池塘生物多样性或池塘大小对所需采样工作有任何影响。我们注意到，我们的池塘相对较小（<2公顷），因此，eDNA的扩散——无论是通过对流还是鱼类移动——可能确保了池塘中eDNA的相对均匀分布，从而能够检测到所有存在的物种，无论物种数量或池塘大小如何。然而，这种现象似乎并不仅限于较小的静水系统。一项在英国进行的大规模研究发现，无论湖泊大小如何，大约10-20个eDNA样本就足以量化静水系统的生物多样性（Sellers等人，2024年）。同样，在面积在5-91公顷之间的静水系统中，溪红点鲑（Salvelinus fontinalis）的eDNA浓度变化与湖泊大小无关（Yates等人，2023年）。因此，有必要进一步研究影响静水系统中eDNA分布异质性的生态参数，以优化eDNA生物多样性调查。最后，我们的研究增加了越来越多的证据，表明eDNA的宏条形码读取次数通常与鱼类数量呈正相关——在M-Mito标记的情况下，这种相关性尤为显著（例如，H?nfling等人，2016年；Di Muri等人，2020年；Boivin-Delisle等人，2021年；参见Rourke等人，2022年的综述）。宏条形码读取次数在多大程度上能够准确评估或预测鱼类数量仍有待确定，因为许多因素（包括引物扩增偏差和抑制作用）可能会影响这些变量之间的关系（Yates等人，2021年）。因此，从宏条形码数据中得出准确或可靠的鱼类数量估计可能具有挑战性。尽管如此，最近的研究在消除引物扩增偏差对eDNA宏条形码读取次数的影响以及推断样本中原始eDNA浓度方面取得了实质性进展（Shelton等人，2022年；Guri等人，2024年）。通过进一步整合自然生态系统中eDNA的产生及其动态（Yates等人，2021年），或许可以利用eDNA宏条形码来粗略估计水生生态系统中的鱼类数量。

**结论**

我们的研究的独特之处在于，我们将eDNA采样与传统的鱼类调查方法（电捕鱼和围网捕鱼）相结合，以估计随后被排干的池塘中的生物多样性，并提供了鱼类种群的绝对数量统计。研究表明，eDNA提供的鱼类生物多样性估计结果与传统依赖于物理标本捕获的技术相当。此外，eDNA在检测低丰度物种时比传统方法更为敏感。然而，eDNA也更容易出现假阳性结果，因此需要仔细考虑序列读取的过滤程度和对eDNA结果的解释。我们的工作强调了eDNA宏条形码在提供物种数量粗略估计方面的潜力，尽管这需要整合eDNA的生态学和动态特性，并改进技术流程，以便将宏条形码读取次数与初始eDNA浓度联系起来。

**致谢**

我们感谢加拿大渔业和海洋部的工作人员在收集eDNA样本和鱼类样本方面的协助，包括Jon Midwood、David Reddick、Erin Budgell、Emily Welsh、Marcus Rizzuto和Melanie Atanassova。同时，我们也感谢汉密尔顿市的Amanda Wong在采样工作上的合作与支持。我们感谢James Hughes在无人机操作方面的帮助。此外，还要感谢Jaefer Mohamad、Tharusha Wijewardena、Wenwen Cai、Yuanyan Zi、Kyle Banwell、Omar Sammarraei、Yuheng Lui、Alyssa White、Allison Smith和Rahma Samarraie在野外工作上的支持。我们还要感谢Jonathon Leblanc、Keta Petal、Sarah St. Louis、Joe Bragnet、Shelby Mackie和Kiera Harshaw在实验室工作上的帮助。同时，我们也感谢三位匿名审稿人的宝贵意见和建议，这些意见极大地提升了手稿的质量。GENFISH网络、NSERC Discovery基金（DDH、NEM、HJM）和加拿大研究主席职位（HJM）为该项目提供了资金支持。该项目的额外资金还来自DFO的生态系统和海洋科学基金（CMB）下的竞争性科学研究基金。