“叶载实验室”：生物印迹玉米醇溶蛋白薄膜与天然微流控技术在集成光子传感中的应用

《Materials Today Communications》：Lab-on-leaf: Bioimprinted zein films and natural microfluidics for integrated photonic sensing

　　拉克尔·瓦兹（Raquel Vaz）、伊莎贝尔·B·奥利维拉（Isabel B. Oliveira）、伊莎贝尔·库尼亚（Isabel Cunha）、维托尔·瓦斯康塞洛斯（Vitor Vasconcelos）、M·戈雷蒂·F·萨莱斯（M. Goreti F. Sales）、曼努埃拉·F·弗拉斯科（Manuela F. Frasco）
来自葡萄牙科英布拉大学科学与技术学院化学工程系、CEMMPRE和ARISE组织的BioMark团队

**摘要**
现场生物传感应用在样品处理、微型化及自动化方面面临诸多挑战。微流控技术作为关键解决方案，实现了精确的流体控制，提升了反应效率和可扩展性。然而，对合成材料的依赖引发了关于可持续性和环境影响的担忧。通过整合天然生物聚合物，可以开发出环保的传感平台，从而应对这些挑战。本研究提出了两种基于生物启发的概念验证平台，将光子转换技术融入天然微流控结构中，并利用叶片脉络图案作为通道模板，因为这些图案具有天然的流体传输效率。第一种方法采用基于玉米醇溶蛋白（zein）的微流控平台，通过斑马鱼胚胎实验评估其毒性，未发现显著不良影响，表明该材料是安全且可持续的传感器材料选择。第二种方法将叶片的血管结构通过生物印迹技术转移到微流控系统中，并在检测区域组装光子结构。这些研究为“叶载实验室”设备奠定了基础，这类设备结合了可再生材料和生物启发式设计，实现了可持续的微流控平台。

**1. 引言**
便携式生物传感应用领域随着对快速诊断和实时环境监测需求的增长而不断发展。为应对这些挑战，传感系统必须满足世界卫生组织提出的REASSURED标准（实时连接性、样本采集便捷性、经济性、灵敏度、特异性、用户友好性、快速性、无需专用设备以及可交付给最终用户）[1][2]。生物传感器提供了快速、选择性强且成本效益高的检测方法[3]。然而，要充分发挥其潜力并为全球健康目标（包括联合国可持续发展目标）做出贡献，生物传感器仍需克服样品处理、微型化和自动化方面的难题。

微流控技术在这方面发挥了核心作用，实现了精确的流体控制，提高了灵敏度并减少了样本用量[4][5]。它们能够在微尺度通道内操控流体，促进快速混合和高效的热量及质量传递，并在纳米和皮升级别实现精确控制，成为精细化学和生物过程的宝贵工具[6]。聚二甲基硅氧烷（PDMS）因其光学透明性、图案化精度、耐用性和可重复性而成为微流控系统的常用材料[6]。不过，其环境影响和洁净室制造成本问题促使人们探索替代方案[7][8]。天然生物聚合物（如玉米醇溶蛋白）为合成聚合物提供了有前景的替代品。玉米醇溶蛋白是从玉米中提取的蛋白质，是一种农业副产品，具有可持续性和低成本优势，适合用于此类设备[9][10][11][12][13]。其他改进措施包括简化设计和提高可访问性，例如采用开放式通道、纸质微流控技术、3D打印、柔性基底以及将传感器集成到微流控系统中。特别值得关注的是开发能够沿微通道润湿梯度引导流体流动的开放式微流控设备，这种设计模仿了水在叶片等自然表面的毛细作用[14]。这些进展不仅深化了对基于生物聚合物的微流控技术的理解，还为下一代环保传感技术开辟了新路径。

**2. 材料与方法**
2.1. **化学品**
所有化学品均为分析级，无需进一步纯化即可使用。玉米醇溶蛋白、甘油、3-羟基酪胺氯化物、2-羟基乙基纤维素（HEC，平均分子量720,000 g/mol）、氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2·6H2O）和氯化钙（CaCl2·2H2O）购自Sigma-Aldrich；Tris（羟甲基）氨基甲烷购自Fisher BioReagents；无水乙醇和氢氧化铵购自Honeywell；氯化钠（NaCl）购自VWR International；柠檬壳胶购自Restaurar&Conservar；正硅酸四乙酯（TEOS）购自Alfa Aesar；十二烷基硫酸钠（SDS）和乙二醇（EG）购自TCI America。整个研究过程中使用超纯实验室级水（电导率<0.06 μS cm-1）。

2.2. **基于玉米醇溶蛋白的薄膜制备**
制备了四种基于玉米醇溶蛋白的薄膜：
- **薄膜I**：将5.45%（w/v）的玉米醇溶蛋白溶解在95%（v/v）乙醇中，再加入2.36%（v/v）甘油混合。
- **薄膜II**：采用相同配方，但添加了0.68%（w/v）柠檬壳胶。
- **薄膜III**：在配方基础上加入0.10%（w/v）多巴胺。
- **薄膜IV**：结合所有四种成分：5.45%（w/v）玉米醇溶蛋白、2.36%（v/v）甘油、0.68%（w/v）柠檬壳胶和0.10%（w/v）多巴胺。
所有溶液在60°C下以450 rpm搅拌90分钟，然后倒入培养皿中并在60°C的马弗炉中干燥5小时。制备完成后，薄膜存放在干燥器中待进一步使用。

2.3. **多巴胺合成**
将143 mg 3-羟基酪胺氯化物溶解在45 mL Tris缓冲液（10 mmol L-1，pH 8.5）和20 mL乙醇中，反应20小时后离心（7500 rpm，15分钟）分离多巴胺颗粒，随后在37°C下干燥过夜。

2.4. **基于玉米醇溶蛋白薄膜的生态毒性研究**
评估急性毒性时，将薄膜I至IV以完整片状或785–910 μm大小的颗粒形式进行测试。颗粒通过咖啡研磨机研磨后过筛获得。新受精的斑马鱼（Danio rerio）胚胎暴露于完整薄膜或颗粒薄膜中（E3培养基，pH 8.6）。E3培养基配方为：1 L超纯水中含有34.8 g NaCl、1.6 g KCl、5.8 g CaCl2·2H2O和9.78 g MgCl2·6H2O。工作溶液为16.5 mL培养基稀释至1 L超纯水中。实验遵循OECD指南236[32]以及欧盟委员会（指令2010/63/EU）和葡萄牙农业、海洋、环境与空间规划部（2013年8月113号法令）关于科学实验动物保护的伦理标准。

暴露实验在24孔板中进行，每孔一个胚胎。测试浓度分别为0.31、0.93、2.80、8.40和25 mg/mL，每个浓度重复10次。实验在受精后1小时至96小时内在28°C的实验室培养箱（VWR, Incu-Line）中进行。对照组仅暴露于E3培养基。每24小时检查一次胚胎，观察死亡迹象（如受精卵凝固、无心跳或体节形成、尾囊脱落）。实验后用新鲜E3培养基补充50%溶液体积。通过四参数对数逻辑模型拟合计算半数致死浓度（LC50），即导致50%胚胎在96小时内死亡的浓度。还记录了亚致死效应（如尾部畸形、心脏或卵囊水肿）。

2.5. **胶体二氧化硅颗粒的合成与表征**
采用St?ber方法合成二氧化硅颗粒，该方法利用氨在碱性条件下催化正硅酸四乙酯（TEOS）的水解和缩合[33]。将59 mL无水乙醇、8 mL氨（25%）和3 mL超纯水在60°C下连续搅拌（600 rpm）混合，加入6 mL TEOS后反应1小时。所得胶体分散液离心（7000 rpm，10分钟）并多次重新悬浮于乙醇中。使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments Ltd.，英国）通过动态光散射（DLS）测定颗粒的粒径和多分散性指数（PDI）。

2.6. **叶片脉络图案的生物印迹与光子结构组装**
将P. verticillatus（瑞典常春藤）叶片的血管结构印迹到基于玉米醇溶蛋白的薄膜上：将叶片置于薄膜上，用两个磁铁夹住并在60°C下压20分钟，随后小心取下叶片。为验证开放式微流控聚合物设备能否在生物印迹的叶片微血管中传输流体，在通道入口处滴入稀释的红色食用色素。使用数码相机拍摄延时照片记录毛细驱动的流体流动情况。整个制造和流体传输测试工作流程被重复多次，以评估其可重复性。作为使用开放式微流控系统构建光子生物传感器的概念验证，选择了薄膜IV。在一些通道的末端加入了由二氧化硅颗粒制成的光子结构。简要来说，在选定的微通道末端施加了2 μL的2.0 wt% HEC溶液，并在28 oC下干燥10分钟，以降低薄膜的孔隙率并促进颗粒的自组装。二氧化硅颗粒（100 mg/mL的乙醇溶液）与水基EG溶液（1 EG:9 H2O）以1:1的比例稀释。然后，将3 μL的胶体颗粒滴加到HEC上。干燥过程包括在室温下干燥30分钟，随后在40 oC下过夜干燥。前30分钟促进了光子晶体的有序排列，而较高的温度确保了溶剂蒸发，同时不损害微流控功能。

2.6. 叶片去细胞化和光子结构组装
另一种创建微流控光子平台的方法是直接使用叶片作为生物基质来支撑光学组装。菠菜叶片被去细胞化以保留其血管聚合物结构。去细胞化协议借鉴了整个器官灌注技术[31]，用0.5 wt% SDS溶液灌注菠菜幼叶72小时，以溶解细胞质膜、脂质和DNA。通过叶柄用针（0.5 × 25 mm）对叶片进行穿刺。针通过塑料管连接到一个小泵上，并在针前放置一个阀门来控制液体灌注量。之后，用1.0%（v/v）的漂白剂溶液灌注叶片48小时以去除剩余的叶绿素。去细胞化后，叶片储存在4 oC的超纯水中。为了评估灌注能力的保留情况，使用注射泵以1 mL/min的速率将稀释的红色食用色素通过叶柄灌注（IPS-14RS注射泵，Inovenso）。整个去细胞化和灌注过程被重复多次，以评估其可重复性。

为了在去细胞化的叶片上创建检测区域以整合光子结构，使用了一个2 mm的活检冲头（Kai Medical，日本）轻轻按压在选定血管通道的叶面。然后在立体显微镜（Leica EZ4）下用镊子小心地移除叶面，保留叶背表面。按照对微血管的方法测试了创建的检测点的灌注能力。为了整合光子纳米结构，向每个点施加了4 μL的1.5 wt% HEC溶液，并在60 °C下干燥10分钟，以防止颗粒在叶片内分散。随后，将4 μL的二氧化硅颗粒（100 mg/mL）滴加到HEC层上，并在室温下干燥。

3. 结果与讨论
3.1. 麦醇溶蛋白基薄膜的生态毒性评估
开发环保材料对于推进生物传感器技术至关重要。由于其可持续性和易于功能化，麦醇溶蛋白基薄膜是一个有前景的替代品[9]，[34]。然而，在应用之前必须仔细评估它们的环境和生物安全性。为此，使用斑马鱼胚胎（一种广泛接受的毒性评估模型）评估了麦醇溶蛋白薄膜I至IV的生态毒性效应，从而能够评估整个生物体的系统性、发育性和器官特异性毒性反应。研究使用了完整的薄膜和颗粒物质（大小从785到910 μm不等）（图1）。在其他颗粒大小上也进行了初步测试，但没有观察到显著的毒性影响。因此，选择了785到910 μm的大小范围以优化样品产量。此外，选定的测试浓度（0.31、0.93、2.80、8.40和25 mg/mL）基于两个因素确定：下限对应于可可靠测量的最小材料量，而上限是根据经验观察得出的在该浓度下完全死亡的水平。分析了不同浓度的薄膜和颗粒的存活率，结果显示浓度对所有薄膜的存活率都有显著影响。对于薄膜I（H(11) = 32.36，p ≤ 0.05），在8.4和25 mg/mL的浓度下，无论是完整薄膜还是颗粒的存活率都显著降低（图1 A）。同样，对于薄膜III（H(11) = 29.82，p ≤ 0.05），仅在8.40 mg/mL和25 mg/mL的浓度下，存活率显著低于对照组（图1 C）。然而，对于薄膜II（H(11) = 30.95，p ≤ 0.05）和IV（H(11) = 36.84，p ≤ 0.05），在2.80 mg/mL的颗粒浓度下存活率就已经降低（图1B和1D）。

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图1. – 斑马鱼胚胎暴露于完整形式和颗粒形式的薄膜I（A）、薄膜II（B）、薄膜III（C）和薄膜IV（D）时观察到的毒性效应。（?）统计上显著差异，p ≤ 0.05。
在几乎所有条件下，颗粒在较低浓度下的死亡率都高于其完整形式，这是由于与胚胎的接触面积增加所致。尽管如此，所有完整和颗粒形式的麦醇溶蛋白薄膜的LC50值都高于100 mg/L（图2 A和2B）。根据OECD关于化学物质和混合物的人类健康和环境危害的统一分类系统[35]，当前结果不属于第三类，该类别包括96小时LC50在10至≤100 mg/L之间的物质。OECD还指出，96小时LC50高于100 mg/L的物质可能被归类为较低毒性。这与Passino和Smith（1987）的分类一致，他们将LC??值在100至1000 mg/L之间的物质描述为“基本上无害”[36]。

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图2. – 斑马鱼胚胎的毒性评估：（A，B）完整和颗粒形式麦醇溶蛋白薄膜的LC50值；（C – E）暴露于薄膜各个成分后的存活百分比：多巴胺（C）、甘油（D）和虫胶（E）。
虽然确定的薄膜LC50值被认为是相对无害的，但薄膜II和IV的颗粒显示出比薄膜I和III的颗粒更低的LC50值。这引发了其中一个成分可能导致观察到的毒性的可能性。因此，还分别评估了各个成分，即多巴胺、甘油和柠檬虫胶（图2C-2E）。在任何测试浓度下，都没有观察到对斑马鱼胚胎的毒性（多巴胺（H(5) = 2.624，p > 0.05）（图2 C），甘油（H(5) = 4.409，p > 0.05）（图2D），和柠檬虫胶（H(4) = 5.706，p > 0.05）（图2E）。然而，最高测试浓度的柠檬虫胶导致了大约20%的死亡率，表明可能存在轻微的毒性。尽管如此，还需要进一步的研究来更好地了解其安全特性。
甘油是一种常用的亲水溶剂，毒性较低。研究表明，甘油的胚胎毒性具有剂量依赖性，0.5%是48小时暴露期内不会影响胚胎存活的最大浓度[37]。在麦醇溶蛋白薄膜中测试的浓度没有对存活产生显著影响，这与文献中的发现一致。此外，一项研究发现多巴胺纳米颗粒的最大非致死剂量为0.5 mg/mL[38]。由于测试的多巴胺浓度低于0.3 mg/mL，因此结果在意料之中。没有关于虫胶的生态毒性概况的先前报告，也没有关于薄膜中麦醇溶蛋白、甘油、多巴胺和虫胶之间相互作用的研究。
基于三个关键参数评估了薄膜成分的亚致死效应：心脏水肿、卵黄囊水肿和尾部畸形（包括脊柱侧弯）（表1）。没有观察到剂量依赖性关系。对于大多数测试的浓度，亚致死效应的发生率与对照组没有显著差异，对照组如预期没有出现异常。亚致死效应通常只在≥ 8.40 mg/mL的浓度下出现，尽管并非总是如此。此外，关于薄膜的组成没有观察到明确的模式。虽然薄膜中存在虫胶与死亡率增加有关，但这一趋势并未扩展到心脏和卵黄囊水肿或尾部畸形的发病率上。
表1 – 显示亚致死效应的斑马鱼胚胎百分比，包括心脏水肿（HE）、卵黄囊水肿（YE）和尾部畸形（TD），无论是完整形式还是颗粒形式。（?）统计上显著差异，p ≤ 0.05。

[生物材料]（mg/mL）
0.31
0.93
2.80
8.40
薄膜
颗粒
薄膜
颗粒
薄膜
颗粒
薄膜
颗粒
薄膜
I
HE
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
3.7 ± 6.4
3.7 ± 6.4
0.0 ± 0.0
85.0 ± 30.0
?
100.0 ± 0.0
?
YE
2.6 ± 6.3
1.1 ± 2.3
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
3.3 ± 5.8
3.7 ± 6.4
30.7 ± 34.0
?
8.8 ± 11.8
87.5 ± 25.0
?
100.0 ± 0.0
?
TD
0.7 ± 1.8
0.0 ± 0.0
2.9 ± 6.4
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
3.7 ± 6.4
0.0 ± 0.0
5.0 ± 10.0
100.0 ± 0.0
?
薄膜II
HE
0.0 ± 0.0
1.6 ± 2.7
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
3.7 ± 6.4
0.0 ± 0.0
27.8 ± 25.5
?
0.0 ± 0.0
-YE
0.0 ± 0.0
1.6 ± 2.7
0.0 ± 0.0
3.3 ± 5.8
0.0 ± 0.0
7.0 ± 6.1
0.0 ± 0.0
38.9 ± 9.6
?
100.0 ± 0.0
?
-TD
1.4 ± 2.5
1.6 ± 2.7
0.0 ± 0.0
3.3 ± 5.8
6.7 ± 5.8
0.0 ± 0.0
5.6 ± 9.6
11.1 ± 19.2
0.0 ± 0.0
-薄膜III
HE
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
10.8 ± 1.4
?
66.7 ± 57.7
?
83.3 ± 23.6
?
YE
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
3.7 ± 6.4
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
21.7 ± 20.2
29.2 ± 16.6
?
0.0 ± 0.0
100.0 ± 0.0
?
TD
0.0 ± 0.0
2.1 ± 3.6
3.7 ± 6.4
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
3.3 ± 5.8
4.2 ± 7.2
14.2 ± 5.2
?
33.3 ± 57.7
0.0 ± 0.0
薄膜IV
HE
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
14.0 ± 13.5
?
37.5 ± 47.9
?
-YE
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
3.3 ± 5.8
62.3 ± 24.0
?
91.7 ± 16.7
?
-TD
2.1 ± 4.2
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
0.0 ± 0.0
38.2 ± 24.8
?
0.0 ± 0.0
-3.2. 叶片印迹麦醇溶蛋白薄膜上的微流控
由于麦醇溶蛋白薄膜的LC50值被认为是相对无害的，因此通过生物印迹技术构建了一个开放式微流控聚合物设备。在叶片上生物印迹微血管提供了一种快速复制复杂静脉图案的方法，具有低成本、易于生产微尺度流体结构的优势。叶片展示了多种3D血管结构，包括网状、弧形、羽状、平行和掌状静脉图案，以及多样的表面拓扑结构[20]。虽然叶片结构的生物多样性提供了多种选择，但确定特定生物测定的最佳叶片可能需要实验选择。为此，通过使用不同植物种的叶片对麦醇溶蛋白薄膜施加压力和热量来进行生物印迹。尽管可以从几片叶片成功转移血管图案，但生物印迹通道的深度通常较浅。相比之下，选择了P. verticillatus的叶片，因为它们的血管结构更坚硬、更明显。因此，使用这种叶片进行了进一步的研究。
在血管图案生物印迹之后，在麦醇溶蛋白薄膜上形成了一个开放式的天然基微流控结构（图3 A）。为了评估该系统用于生物传感应用的流体灌注能力，将稀释的红色食用色素引入生物印迹的叶柄通道中，导致沿叶片衍生通道的毛细驱动流动（图3 A）。在较大的生物印迹通道内的流体传输表现出增加的流动阻力，这可能反映了麦醇溶蛋白薄膜的水敏感性，而长时间的水灌注导致机械稳定性降低。这些观察反映了基于天然生物聚合物平台的更广泛材料挑战，包括机械稳定性、泄漏控制、润湿性调节和异质微结构[39]，[40]，[41]，[42]。

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图3. – 基于麦醇溶蛋白的微流控光子概念验证设备：（A）使用压力和热量将叶片血管生物印迹到麦醇溶蛋白薄膜上，然后可视化通过开放式微流控通道的流体灌注（有色流体表示流动）；（B）将光子结构整合到薄膜IV的生物印迹通道中，展示了该设备作为光子生物传感器的潜力。
之前使用麦醇溶蛋白在传统微流控通道中的研究显示了更强的流体传输能力，其表面润湿性可以通过油酸含量进行调节[43]，[44]。这些发现表明，虽然麦醇溶蛋白是合成材料的可行可生物降解替代品，但生物印迹的开放式、受叶片启发的架构需要进一步优化材料组成和表面特性，以实现机械稳健性和可控的毛细驱动流动。
选择薄膜IV作为概念验证平台，将光子晶格与生物印迹通道集成。选择使用滴涂法沉积二氧化硅颗粒来构建光子晶体，因为这是一种快速且简单的技术，先前的研究已经证明了它能够产生结构化、具有虹彩效果的色彩[29]。合成的二氧化硅颗粒直径为258.9 ± 2.1纳米，粒径分布指数（PDI）为0.02 ± 0.01，表明其具有良好的单分散性。在颗粒沉积之前，先在选定的通道末端涂覆了2.0 wt%的HEC（羟乙基纤维素）层，以减少局部薄膜的孔隙率并促进二氧化硅颗粒在表面的组装。选择HEC是因为它具有亲水性，并且能够形成粘稠溶液，从而便于精确施用[45],[46]。胶体颗粒被稀释在EG（乙二醇）的水溶液中，这可以减缓溶剂蒸发并减少“咖啡环”效应，从而提高胶体薄膜的均匀性和质量[47]。最终形成的光子结构在生物印迹通道的末端显示出虹彩绿色的传感区域（图3B）。尽管结构并不完全均匀，可能是由于薄膜表面的不平整，但该过程成功制备出了可以与不同生物识别元件结合用于未来生物传感应用的光子结构。

3.3. 去细胞化叶片作为微流控光子设备的平台
植物叶片易于获取且具有高度发达的血管系统，其功能结构与动物组织相似，已被广泛研究作为有前景的、伦理上可持续且环保的生物医学应用材料[31],[48],[49],[50],[51],[52],[53]。去细胞化叶片主要在组织工程、伤口愈合和药物输送领域得到研究[54]，但也用于微流控设备和压力传感器[55],[56]。然而，将其作为集成光子转换元件的平台的使用仍然很大程度上未被探索。选择菠菜叶片作为模型物种，是因为它们易于获取、具有明显的血管网络结构和较大的叶柄直径。不过，其他类型的叶片也可以用于此目的。
去细胞化菠菜叶片是通过优化程序获得的：首先用0.5 wt%的SDS（十二烷基硫酸钠）灌注3天，然后使用1.0%（v/v）的漂白剂灌注2天（图4A）。较高浓度的洗涤剂和漂白剂会导致过度的结构损伤，使叶片呈现胶状质地。像SDS这样的离子型洗涤剂在溶解细胞质膜、脂质和DNA方面非常有效，同时能够保留糖蛋白和胶原蛋白等蛋白质，并保持纤维的方向性[48]。使用漂白剂可以去除叶绿素，从而得到透明的支架。开始去细胞化过程一天后，叶片开始失去绿色，因为叶绿体被去除（图4B, 4C）。经过3天的SDS灌注后，叶片变得半透明并带有黄绿色调（图4D, 4E）。继续用漂白剂灌注后，叶片完全透明，因为剩余的叶绿素被清除，支架也被消毒（图4F, 4G）。去细胞化叶片在4°C的超纯水中保存长达一年，没有出现视觉变化或微生物生长，表明细胞物质已被有效去除，菠菜叶片的聚合物血管支架保持完整。

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图4. – 菠菜叶片去细胞化的时间延迟过程。(A) 去细胞化过程示意图；(B) 开始时叶片呈不透明的深绿色；(C-E) SDS灌注过程中透明度逐渐增加；(F-G) 漂白剂灌注完成去细胞化，得到完全透明的叶片。
去细胞化叶片的一个主要优点是它们天然的血管系统，因此需要评估去细胞化后这一系统是否仍然完整且功能正常。为此，使用注射泵通过叶柄灌注稀释后的红色食用色素，从而精确控制流速。在1 mL min-1的流速下，叶片在27 ± 5秒内被完全染色。虽然观察到少量泄漏，但有色液体成功流过了叶片静脉的细小分支，表明微血管系统基本保持完整，能够有效地在整个网络中输送液体（图5A）。

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图5. – 在叶片上构建实验室：(A) 通过菠菜叶片的去细胞化微血管系统灌注有色液体；(B) 创建检测区域，然后向这些区域灌注液体；(C) 在传感器区域组装光子结构，展示该平台在基于叶片的生物传感应用中的潜力。
为了证明这种支架作为天然微流控生物传感设备的可行性，在叶片血管的末端整合了光子结构。使用直径为2毫米的活检针轻轻按压叶片的腹面，然后在立体显微镜下用镊子小心移除，以创建液体将被引导到的检测区域（图5B）。也测试了叶片的背面，但发现背面更薄且更难以移除。此外，背面的血管系统更为明显，使用活检针时需要更大的力，这可能导致叶片撕裂。随后测试了创建的检测区域的灌注能力，液体成功注入检测点，表明微血管系统被有效切割而没有破坏结构（图5B）。偶尔会观察到液体通过叶片表面泄漏，可能是由于液体压力或处理过程中的潜在损伤造成的。
为了整合光子结构，首先在每个点上涂覆1.5 wt%的HEC溶液，然后加入二氧化硅颗粒（图5C）。涂覆一层HEC对于防止颗粒在叶片内分散至关重要。光子组装过程大约在15分钟内完成，采用了滴涂技术。此外，最终形成的光子结构表现出高虹彩性和均匀性，证实二氧化硅颗粒已成功地在去细胞化叶片上形成了周期性结构。未来的工作应集中在完全整合生物识别元件并评估其传感能力上。尽管如此，这是首次报道利用去细胞化菠菜叶片的微血管系统并整合光子结构的天然微流控设备。

去细胞化叶片和生物印迹的zein薄膜都利用了容易获得的天然基底和简单的制造技术，提供了可持续且低成本的平台。去细胞化叶片具有快速的光子结构形成和低材料成本，但即使同时处理多片叶片也需要几天时间来准备。灌注过程也有改进的空间，因为针头插入可能会损坏叶柄，限制后续步骤的可用性。相比之下，带有光子结构的生物印迹zein薄膜可以在24小时内制造出来，尽管其材料组成和表面特性仍需优化以达到最佳性能。
总体而言，这些观察结果突显了基于叶片的微流控平台的一个固有权衡。虽然它们环保且成本效益高，但缺乏传统设备的机械强度。因此，它们可以作为可降解的、受生物启发的、主要用于一次性使用的平台，同时为未来的优化和材料工程提供了机会，以实现更可持续的分析应用。

4. 结论与未来展望
本研究展示了将受生物启发的架构、天然生物聚合物和光子结构成功整合到微流控平台中的方法，提供了一种可持续且成本效益高的替代方案，取代了传统的合成材料。通过两种互补策略：将P. verticillatus叶片的血管结构生物印迹到zein薄膜上，以及利用去细胞化菠菜叶片的天然血管系统，建立了概念验证，利用了自然界在流体传输方面的固有效率。此外，所使用材料的环境安全性确保了最小的生态足迹，符合对可持续生物医学技术日益增长的需求。
除了简单的材料替代外，这项工作还引入了一种受生物启发的设计理念。生物印迹的zein薄膜提供了一种可复制、可扩展的方法，将植物启发的通道整合到可降解的平台上，而去细胞化叶片则重新利用了整个生物血管网络用于传感应用。这些策略共同展示了天然模板和生物聚合物在创新传感器平台方面的多功能性，使实现基于叶片的实验室技术更近了一步。
实际应用仍面临挑战。叶片大小、几何形状和季节性的变化可能会影响可重复性和可扩展性。未来的研究应探索不同的植物种类，以确定最佳的结构和流体特性，并进一步优化去细胞化过程，以减少准备时间。
总之，这项研究为通过受生物启发和生物印迹设计建立了可持续生物传感技术的基础。通过利用天然架构，它展示了易于获取、环境兼容的传感平台，为下一代现场健康和环境监测设备铺平了道路。材料加工和微制造的持续进步将进一步实现可靠、可扩展和可持续的分析技术。

CRediT作者贡献声明
Manuela F. Frasco：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、方法论、概念化。
M. Goreti F. Sales：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取。
Vitor Vasconcelos：撰写 – 审稿与编辑、资源准备。
Isabel Cunha：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法论、形式分析。
Isabel B. Oliveira：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法论、形式分析。
Raquel Vaz：撰写 – 原始草稿、可视化、方法论、调查、形式分析、数据管理、概念化。