荧光标记体外蛙细胞感染模型：量化蛙壶菌致病性的新方法

《Methods》：Using fluorescent in vitro amphibian cell infection models to quantify Batrachochytrium dendrobatidis pathogenicity

为应对两栖类壶菌病缺乏高效研究手段的困境，本研究利用荧光标记Batrachochytrium dendrobatidis (Bd)构建体外蛙细胞感染模型，开发了ImageJ定量、流式细胞术等6种病原负载与宿主损伤检测方法，显著提升疾病机制研究的精准度，为抗真菌策略研发提供关键技术支持。

　　

在全球两栖动物种群面临生存危机的当下，一种名为壶菌病（chytridiomycosis）的致命真菌疾病正悄然引发生态灾难。由蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis, Bd）引起的这种疾病，已导致全球约700种两栖动物数量锐减甚至灭绝。这种真菌通过破坏两栖动物皮肤的渗透调节功能，最终使宿主因电解质失衡而死亡。然而，尽管其危害巨大，科学界至今仍未找到有效的防控方案——这背后，是传统研究方法面临的诸多瓶颈。

长期以来，壶菌病研究主要依赖活体动物实验（in vivo）或单纯的真菌培养基实验。前者面临伦理争议、成本高昂且难以精细调控变量；后者使用的胰蛋白胨培养基（tryptone）无法模拟宿主内环境，导致实验结果与实际情况存在偏差。更棘手的是，现有检测技术如qPCR会因真菌DNA残留产生干扰，而常规细胞活性检测方法（如MTT法）又会因Bd自身的代谢活动而失效。这些限制严重阻碍了对真菌毒力因子和宿主抗性机制的深入探索。

在此背景下，墨尔本大学研究团队另辟蹊径，开发出一套创新的“荧光标记体外蛙细胞感染模型”。他们利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）肾脏上皮细胞系A6作为宿主模型，并通过基因工程使Bd稳定表达红色荧光蛋白（tdTomato）。这一设计不仅解决了传统方法的技术难题，更实现了对感染过程的实时可视化监测。

该研究最核心的贡献，在于建立了一套完整的“定量工具箱”。针对病原负载检测，团队验证了三种荧光定量方法：通过ImageJ软件分析荧光显微图像，可精确计算真菌占据的表面积；使用荧光分光光度计测量，能快速获得整体荧光强度数据；而流式细胞术则能统计被感染细胞的百分比。这三种方法在不同温度条件下（19℃支持Bd生长，27℃抑制生长）均表现出良好的剂量效应，证实了其可靠性。

在宿主细胞损伤评估方面，研究团队创新性地优化了多种检测方案。他们发现，低浓度DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）短暂处理可特异性标记受损细胞——健康细胞膜能阻挡DAPI进入，而Bd入侵造成的膜损伤会使细胞核被染色。通过统计DAPI阳性细胞数量，可量化感染导致的细胞损伤程度。针对传统MTT法（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）易受Bd代谢干扰的问题，团队先采用特比萘芬（terbinafine）和高温处理灭活真菌，再检测A6细胞的代谢活性，成功排除了干扰因素。此外，结晶紫染色结合图像分析也能反映感染后细胞表面积的变化，间接评估细胞健康状况。

这些方法在实验中展现了出色的应用价值。当A6细胞在19℃（Bd最适生长温度）下培养时，所有检测指标均与感染剂量呈显著正相关：荧光信号随Bd数量增加而增强，DAPI阳性细胞比例上升，MTT活性下降，细胞表面积缩小。而在27℃条件下，各项指标变化微弱，与理论预期一致。特别值得注意的是，即使在不支持Bd生长的温度下，高浓度真菌仍能引起细胞轻微损伤，提示Bd可能分泌某些毒性代谢产物。

该研究建立的“定量工具箱”具有多重科学意义。首先，它首次实现了对壶菌病感染模型中病原与宿主变化的同步精准量化，为比较不同Bd菌株毒力、筛选抗真菌药物提供了标准化平台。其次，荧光标记技术使实时观察感染动态成为可能，有助于揭示真菌入侵机制的时间规律——实验显示细胞损伤最早出现在感染后18小时，与Bd菌丝侵入时间高度吻合。再者，流式细胞术的应用为后续分离感染/未感染细胞进行转录组分析奠定了基础。

当然，该模型仍有优化空间。目前使用的A6细胞系源于肾脏，与Bd的自然感染部位（皮肤）存在差异。未来若能建立两栖动物皮肤上皮细胞系，甚至构建具有分层结构的皮肤类器官，将极大提升模型的生物学相关性。此外，开发区分细胞内/外生长真菌的定量方法，也将深化对Bd致病机制的理解。

这项发表于《Methods》的研究，标志着壶菌病研究迈入了“精准量化时代”。其建立的系列方法不仅适用于Bd，还可扩展至其近亲物种——感染蝾螈的Bsal（Batrachochytrium salamandrivorans）。在生物多样性保护日益紧迫的今天，这种高效、可控、符合伦理的研究范式，无疑将为拯救濒危两栖动物提供关键的科学武器。

主要技术方法：研究采用荧光蛋白标记的Bd感染非洲爪蟾A6细胞系，通过对比19℃与27℃培养条件，系统验证了ImageJ图像分析、荧光分光光度法、流式细胞术、DAPI损伤标记、改良MTT代谢检测及结晶紫染色等6种定量方法。样本为实验室培养的A6细胞与转基因Bd菌株，所有实验均设置多重感染指数梯度并进行技术重复。

研究结果：

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  荧光定量病原负载：ImageJ分析显示19℃下Bd荧光面积与感染剂量呈强相关（R²=0.8812）；分光光度法证实荧光强度随剂量增加（R²=0.9076）；流式细胞术测得感染细胞比例最高达35%。
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  宿主细胞损伤评估：DAPI染色首次检测到损伤发生在感染后18小时，阳性细胞数量与感染剂量正相关；改良MTT法显示19℃下细胞活性显著下降（R²=0.8969）；结晶紫染色发现高剂量感染致细胞表面积减少。

结论与讨论：本研究建立的系列定量方法首次实现对壶菌病体外模型中病原负载与宿主损伤的同步精准监测。荧光标记技术克服了传统qPCR的DNA残留问题，DAPI损伤标记与改良MTT法有效排除了病原代谢干扰。该工具箱为比较菌株毒力、筛选抗真菌药物提供了标准化平台，其非破坏性检测特性（如荧光成像）支持实时观察感染动态。尽管A6细胞与天然皮肤存在差异，但模型成功模拟了Bd的完整生命周期，未来结合皮肤类器官技术有望进一步提升生物学相关性。这些方法可扩展应用于Bsal等近亲病原体研究，对制定两栖动物保护策略具有重要实践价值。