《Modern Pathology》：Detection of prostate cancer in 3D pathology datasets via generative immunolabeling
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前列腺癌3D病理分析中，开发SIGHT流程通过深度学习模型将H&E染色数据转化为合成免疫标记数据，自动区分癌性和良性腺体。该方法基于CK5/CK8差异表达，生成可解释的3D热力图，验证显示其F1分数（0.88）与病理专家一致性（0.90）相当，并初步证实3D glandular分析可提升复发风险分层效果。
罗伯特·B·塞拉芬（Robert B. Serafin）|詹妮弗·萨尔格罗·洛佩兹（Jennifer Salguero Lopez）|苏·周（Suet Chow）|王睿（Rui Wang）|赵玉洁（Yujie Zhao）|埃莱娜·巴拉兹涅诺克（Elena Baraznenok）|莉迪亚·兰（Lydia Lan）|凯文·毕晓普（Kevin Bishop）|米歇尔·唐斯（Michelle Downes）|泽维尔·法雷（Xavier Farre）|劳伦斯·D·特鲁（Lawrence D. True）|普里蒂·拉尔（Priti Lal）|阿南特·马达巴胡希（Anant Madabhushi）|刘俊涛（Jonathan T.C. Liu）
华盛顿大学机械工程系，西雅图，华盛顿州 98195
摘要
非破坏性3D病理学的最新进展为标准组织学提供了补充，使得能够对完整的临床样本（例如活检样本）进行全面的体积分析。先前的研究已经证明了3D病理学在前列腺癌风险分层中的附加预测价值，通过将3D微观结构特征与患者的长期结果相关联。然而，这些分析依赖于对富含癌细胞的区域进行粗略的手动注释，而没有详细区分通常混合在一起的癌性和良性腺体。为了自动化并改进3D病理数据集中良性区域和前列腺癌富集区域之间的区分过程，我们开发了一个3D计算流程：合成免疫标记生成肿瘤热图（SIGHT）。SIGHT依赖于基于深度学习的3D图像转换模型，这些模型经过完全监督的训练，可以将H&E模拟的3D病理数据集转换为多通道3D免疫荧光数据集，从而便于肿瘤检测。我们实现的SIGHT合成了两种在癌性和良性前列腺腺体中差异表达的细胞角蛋白标记物，用于生成可解释的前列腺组织中富含癌细胞的3D热图。将SIGHT与一组泌尿生殖系统病理学家的地面真实注释进行验证，平均F1分数为0.88，这与病理学家之间的平均一致性F1分数0.90相当。为了展示SIGHT如何自动化并改进基于3D病理数据集的前列腺癌风险分层流程，我们基于75名患者的3D腺体组织形态学特征开发了初步的机器分类器。在SIGHT识别的富含癌细胞的区域与所有组织区域中进行体积分析，得到的Kaplan-Meier风险比为3.57（1.6 – 7.9 CI）对比0.92（0.45 – 1.89 CI）。
引言
多年来，各种癌症的管理方式不断发展；然而，活检的组织学评估基本上仍然是诊断的金标准。在标准实践中，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的活检样本被处理成几层薄片（约5微米厚），然后安装在玻璃载玻片上，并用苏木精和伊红（H&E）染色以突出细胞核和其他所有组织结构。这些H&E载玻片的视觉解释在患者管理中起着重要作用。例如，为了确定前列腺癌（PCa）的侵袭性——这是男性中第二常见的癌症1，病理学家依赖于格里森分级系统234。格里森分级是预测PCa结果的最强指标，因此在治疗建议中得到了广泛应用。然而，不同病理学家之间的格里森分级存在较高的变异性567。这部分是因为格里森分级依赖于对复杂分支腺体形态的主观评估，而在观察2D组织切片时这可能具有模糊性和误导性。此外，病理学家通常只审查每个活检样本中的一小部分组织切片，通常不到活检体积的1%8。鉴于不准确的诊断和分级对所有癌症（包括PCa）的健康和财务影响，能够更准确地将对患者进行风险分类具有重要意义。
组织清除技术、高通量3D显微镜和计算工具的最新进展促进了非破坏性3D病理学这一领域的快速发展9101112131415。与标准组织学不同，这些创新允许对大型临床样本（如手术切除物或活检样本）快速标记小分子荧光类似物，并在不进行物理切片的情况下对其进行完整成像（图1A，补充材料，视频S1）。非破坏性3D病理学生成的数据量比标准2D组织学多几个数量级，包括新的体积洞察/特征，这些特征已被证明可以提高诊断准确性16171819。先前的研究通过分析前列腺活检的3D形态特征并将其与患者结果相关联，证明了非破坏性3D病理学的预测价值。在这些研究中，使用开放式光片（OTLS）显微镜对1毫米芯针活检样本中的腺体和细胞核形态进行了量化。尽管这些研究表明3D特征在患者风险分层方面优于类似的2D特征，但这些早期研究依赖于病理学家手动识别每个活检样本中富含癌细胞的区域以进行后续计算分析。这些粗略的手动注释不足以在前列腺组织中通常混合的良性腺体和癌细胞之间提供详细区分，这可能会降低计算分类器的准确性202122。因此，在这项技术发展研究中，我们旨在开发一个自动化区分3D病理数据集中良性区域和癌性区域的流程（图1B和1C），具有腺体级别的准确性，从而消除病理学家对富含癌细胞区域进行繁琐的3D注释的需要。我们还初步展示了我们的3D癌症热图在基于3D腺体特征改进风险分层方面的价值。
在标准临床实践中，病理学家经常依赖细胞角蛋白标记物的免疫组化染色来区分良性前列腺腺体和恶性前列腺腺体
23。正常的前列腺腺体由两层上皮细胞组成：基底细胞层，表达高分子量的细胞角蛋白-5（CK5）；以及管腔细胞层，表达低分子量的细胞角蛋白-8（CK8）。在最常见的前列腺腺癌（PCa）中，基底细胞层消失，癌性腺体由单层管腔上皮细胞组成（图2）。尽管抗体具有极高的分子特异性，但它们价格昂贵且在大型完整组织中的扩散非常缓慢，例如用于非破坏性3D病理学的组织。相反，小分子荧光剂（如本研究中使用的H&E类似染色剂）既便宜又在厚组织中快速扩散。合成免疫标记利用生成式深度学习模型来预测分子靶标的表达，可以绕过2D和3D病理学应用中对抗体的需求
17,24252627。此外，这种“生成式免疫标记”策略已被证明对于可以根据H&E类似图像由领域专家识别的组织结构具有很高的准确性
17,272829。
我们之前开发了一个合成免疫标记流程，使用生成对抗网络（GAN）来预测用小分子荧光类似物标记的芯针活检样本中CK8的位置17,30。这反过来使得可以3D分割所有含有表达CK8的管腔上皮细胞的前列腺腺体。在2022年的研究中，通过沿每个活检样本中癌细胞存在的长度的轴向坐标手动定义了富含癌细胞的区域。这种方法需要专家病理学家进行劳动密集型的审查，以验证各个活检样本中富含癌细胞区域的存在和范围。此外，我们之前方法的一个主要限制是，默认情况下，手动识别的富含癌细胞的体积内的所有腺体都被视为癌细胞，尽管这些区域中经常混合有良性腺体。当时没有方法可以区分单个腺体是良性还是癌性腺体。此外，这种手动方法仅因为芯针活检的线性几何形状而可行，病理学家可以使用轴向坐标来标注癌细胞的存在。虽然对我们的先前工作有效，但这种策略不能推广到具有任意几何形状的其他临床样本，如穿刺活检或整个器官的大块切片。
我们后来假设，我们的合成免疫标记方法可以扩展到预测前列腺活检3D数据集中CK8（管腔细胞）和CK5（基底细胞）的表达，以一种对病理学家有吸引力的方式（即基于标准护理细胞角蛋白生物标志物的免疫标记）来区分癌性和良性腺体（图1B，补充材料，视频S2）。我们认识到，开发这样的计算框架——合成免疫标记生成肿瘤热图（SIGHT）将首次实现多种3D计算任务的完全自动化（图1C，补充材料，视频S3和S4）。此外，我们推测SIGHT可以通过提供细粒度的3D癌症热图来潜在地提高这些下游分析任务的准确性，而这对于人类病理学家来说在大组织规模上是不可行的。
为了展示SIGHT生成的3D PCa热图的价值，我们分析了75个已知生化复发（BCR）结果的根治性前列腺切除术样本中获得的3毫米穿刺活检样本。我们的假设是，对富含癌细胞的区域（通过SIGHT自动识别）与所有组织区域进行3D分析将显著提高分类器的性能。
部分片段
组织制备
从根治性前列腺切除术（RP）样本的FFPE块中获取直径为3毫米的组织穿刺样本，并在60°C的二甲苯（Fisher Scientific，目录号X3P-1GAL）中脱蜡48小时。脱蜡后，将穿刺样本在100%乙醇（Decon Laboratories，目录号2701）中洗涤两次，每次1小时9。对于H&E类似染色，使用TOPRO-3碘化物（Cat: T3605，Thermo-Fisher）以1:500的稀释度进行染色，以及Alcoholic Eosin Y 515（Cat: 3801615，Leica Biosystems）以1:100的稀释度进行染色
模型训练和验证
为了训练用于自动区分3D病理数据集（H&E模拟）中富含PCa区域的合成免疫标记模型，我们从华盛顿大学IRB批准的泌尿生殖系统生物库中收集了15个根治性前列腺切除术（RP）样本的FFPE块。每个FFPE块被切成100微米厚的切片，脱蜡，并用H&E的荧光类似物（TOPRO-3和伊红）以及两种细胞角蛋白抗体之一进行三重标记（针对
讨论
近年来，人们一直在努力将3D高分辨率成像模式从传统研究应用扩展到临床环境。然而，考虑到这种高分辨率3D病理数据集的庞大体积和复杂性，越来越需要计算工具来帮助临床医生进行解释和辅助临床决策。在各种计算方法中，结合直观性被认为具有价值
伦理声明和患者同意
本研究中使用的根治性前列腺切除术样本存放在华盛顿大学和宾夕法尼亚大学的IRB批准的泌尿生殖系统生物库中。
作者贡献
罗伯特·塞拉芬（R. Serafin）：概念化、数据管理、软件开发、正式分析、验证、研究、可视化、方法论、原始草稿撰写、审稿和编辑。詹妮弗·S·洛佩兹（J. S. Lopez）：数据管理、软件开发、正式分析、方法论。苏·周（S. Chow）：数据管理、软件开发、正式分析、组织制备。王睿（R. Wang）：软件开发、方法论。埃莱娜·巴拉兹涅诺克（E. Baraznenok）：数据管理、组织制备。莉迪亚·兰（L. Lan）：数据管理、组织制备。凯文·毕晓普（K. Bishop）：数据管理。米歇尔·唐斯（Michelle Downes）：数据管理。X.
作者披露
刘俊涛（J.T.C. Liu）是Alpenglow Biosciences Inc.的联合创始人、股权持有人和董事会成员，该公司获得了他实验室开发的3D病理技术的许可，包括与开放式光片（OTLS）显微镜相关的专利。
劳伦斯·D·特鲁（L.D. True）是Alpenglow Biosciences, Inc.的联合创始人及股权持有人。
致谢
本出版物中报告的研究得到了ARPA-H的支持，合同编号为D24AC00357（刘俊涛）和D25AC00140（阿南特·马达巴胡希）。研究还得到了国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）的支持，合同编号为R01EB031002（刘俊涛），国家糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所（NIDDK）的支持，合同编号为R01DK138948（刘俊涛），以及国家癌症研究所（NCI）的支持，合同编号为R01CA268207（刘俊涛和阿南特·马达巴胡希）、R01CA268287（阿南特·马达巴胡希）、U01CA269181（阿南特·马达巴胡希）、R01CA249992
