《Reproduction in Domestic Animals》：Comparative Evaluation of Follicular Flushing Frequency and Scraping Time During Ovum Pick-Up in Mares: Effects on Oocyte Recovery Rate and Technical Considerations
编辑推荐：
本文探讨了母马经阴道超声引导采卵过程中，多次卵泡冲洗与单次冲洗结合连续刮擦对卵母细胞回收率的影响。研究发现，在总刮擦时间相同的情况下，两种方法对回收率无显著差异，但单次冲洗可减少冲洗液用量。研究强调了优化刮擦时间在提升技术效率、降低成本和减少操作者疲劳方面的重要性。
综述摘要
1 引言
经阴道卵泡穿刺，或称采卵，已成为获取母马未成熟卵母细胞以用于通过卵胞浆内单精子注射或体外受精技术进行体外胚胎生产的标准技术。其效率的一个主要指标是卵母细胞回收率。在技术发展过程中，母马的卵母细胞回收率表现出高度可变性。
最初，该技术是从牛身上借鉴而来，并未考虑物种间在排卵前卵母细胞-卵丘复合体附着于卵泡壁的解剖和生理差异，这在母马中显著阻碍了卵母细胞的释放。在自然排卵过程中，卵母细胞会逐渐从卵泡壁脱离；但由于采卵程序通常在此生理性脱离完成之前进行，卵母细胞仍附着在致密的细胞和细胞外基质中。当前的共识是，母马卵母细胞中卵丘的连接比其他物种更强，因此仅通过抽吸通常无法将卵母细胞从卵泡壁上分离。
随后，为了改善母马的卵母细胞回收率，引入了几项技术改进，包括使用双腔针、在卵泡应用期间旋转针头、特定的抽吸和注射压力，以及结合使用肝素化培养基进行重复的卵泡冲洗。然而，关于冲洗次数和刮擦时间中哪个变量是改善回收率的主要原因，仍存在疑问。
2 材料与方法
本研究采用了一种对照实验方法，分为两个阶段：使用屠宰场来源卵巢的离体阶段和在活体母马中进行的在体阶段。在两个阶段中，均应用了标准化的采卵方案，并设置了两个实验组：多次冲洗组和单次冲洗组，同时保持卵泡壁刮擦类型恒定。多次冲洗组中，每个卵泡冲洗10次，每次冲洗间歇期间对塌陷的卵泡壁进行刮擦，每次刮擦平均1.8秒，总计刮擦时间18秒。单次冲洗组中，卵泡被抽吸后，连续刮擦卵泡壁18秒，然后进行一次冲洗。
主要测量结果是在不同技术条件下每个被抽吸卵泡的卵母细胞回收率。次要参数包括所有重复试验的抽吸时间和使用的培养基体积。在活体母马中，还记录了因堵塞而需要冲洗抽吸系统的次数以及培养皿中出现的血凝块数量。
离体阶段共抽吸了32个切除的卵巢，分为两组，每组进行9次重复。在体阶段纳入了9匹年龄在5至22岁之间、品种不同的临床健康母马。
采卵程序使用连接到超声扫描仪的经阴道超声探头，在超声引导下使用双腔针进行抽吸和冲洗。使用添加了肝素的乳酸林格氏液作为冲洗培养基。
抽吸后，由对实验组不知情的操作者负责卵母细胞检索。抽吸液通过尼龙滤网过滤，滤网截留的物质在立体显微镜下检查。
3 结果
3.1 离体
离体阶段结果显示，多次冲洗组的平均卵母细胞回收率为63.8% ± 11.4%，单次冲洗组为59.5% ± 11.6%，两组间无显著差异。同样，从总体卵泡回收的卵母细胞数量比例也未见显著差异。然而，多次冲洗组每个卵泡使用的冲洗培养基体积显著更高。两组间抽吸一个卵泡所需的平均时间没有显著差异。
3.2 在体
在体阶段结果显示，多次冲洗组的平均卵母细胞回收率为48.3% ± 23.6%，单次冲洗组为44.3% ± 13.8%，无显著差异。总体卵母细胞获取率亦无显著差异。两组在每卵泡冲洗液用量、每卵巢抽吸系统堵塞次数或所需冲洗次数方面均未发现显著差异。同样，每卵泡的抽吸时间在两组间具有可比性。最后，每组重复试验回收的血凝块数量也无显著差异。
斯皮尔曼相关性分析显示，凝块形成与抽吸系统堵塞之间存在中度正相关，具有统计学显著性，这表明凝块数量越多，抽吸系统堵塞的频率越高。
在过滤过程中，凝块经常呈现细长、意大利面条状的形态。此外，培养皿中的凝块通常会向培养基中释放红细胞，使其呈淡红色，影响卵母细胞搜索时的可见度。在移除凝块的培养皿中未发现卵母细胞。
4 讨论
本研究首先进行了离体实验，以遵循动物实验的减少、优化和替代原则。虽然离体模型已被证明是分析影响卵母细胞回收率因素的可靠工具，但完全替代在本研究中并不可行。母马活动、抽吸系统中血液或凝块的存在等参数只能在在体条件下评估。
在体结果与离体系统获得的结果一致，支持死后采卵模拟器作为分析影响卵母细胞回收率变量工具的有效性。两项研究间观察到的卵母细胞回收率微小差异可能与操作者经验有关。尽管由同一操作者执行所有程序，但其在体技术的经验要低得多。本研究中获得的总体平均卵母细胞回收率略低于类似地理区域内单操作者报告的值，证实了先前关于操作者专业知识对卵母细胞回收率影响的证据。离体模拟器增强了处理超声探头、针头和抽吸泵的技能，然而，在体技术引入了额外的挑战。
众所周知，可用和抽吸的窦卵泡数量与回收的卵母细胞数量以及采卵结合卵胞浆内单精子注射程序的总体成功率呈正相关。本研究中抽吸的卵泡数量低于先前在欧洲报告的数量，这是由于动物数量有限、实验时间受限，且无法根据窦卵泡计数选择母马。
目前的发现表明，卵泡刮擦的持续时间对卵母细胞回收率的影响大于冲洗次数。先前有离体研究报告称，增加冲洗次数与卵母细胞回收率呈正相关；然而，在这些研究中，冲洗次数的增加伴随着刮擦时间的延长，这表明卵母细胞回收率的改善可能主要归因于刮擦而非冲洗，这与我们的结果一致。
卵泡刮擦的效率一直存在争议。其在采卵中的应用源于死后研究，这些研究表明，与仅用注射器抽吸相比，用骨刮匙刮擦卵泡能显著提高卵母细胞回收率。随后的离体研究表明，仅刮擦就能将卵母细胞回收率提高高达12%。然而，在体研究并未报告进行10次冲洗时，无论是否刮擦，卵母细胞回收率存在显著差异。
这些发现凸显了关于冲洗次数和刮擦对卵母细胞回收率真实贡献的争议。明显的差异可能反映了这两个变量的联合、非加性效应。在本实验中，对刮擦时间的精确控制揭示，主要是这个参数，而非冲洗次数，主导性地影响了卵母细胞的回收。这些结果强调了在优化采卵方案时考虑技术变量间相互作用的重要性，而非孤立地看待其各自效应。
在本研究中，持续旋转针头18秒增加了操作者疲劳，这可能对卵母细胞回收率产生负面影响，因为疲劳的操作者可能无法有效地执行刮擦。虽然刮擦时间是卵母细胞回收率的关键决定因素，但实现可接受的卵母细胞回收率且不引起操作者疲劳的最佳旋转时间仍有待确定。此外，单次冲洗系统的连续旋转似乎使卵泡可视化变得复杂，这可能增加针头移位的可能性。
抽吸系统堵塞次数和培养皿中观察到的血凝块数量在单次冲洗组中趋于更高，尽管差异无统计学显著性，可能是由于样本量有限。在连续刮擦期间，静态液体中的单次冲洗会促进长而窄的管路系统中凝块的形成和系统堵塞，而多次冲洗允许更大的液体循环。凝块呈现出意大利面条状的形态。这种外观可能是由于在没有冲洗的情况下，血液残留物在管路内长时间停滞所致，这会促进在系统最窄点（如抽吸针）的堵塞。在这些情况下，通常需要更换针头或采用开放系统，这可能影响卵母细胞回收率，损害无菌性，并延长程序的总体持续时间。
有趣的是，凝块数量较多与卵母细胞回收率较低并无直接相关性；然而，它们的存在增加了堵塞频率，从而增加了系统冲洗次数和使用的冲洗培养基总体积。这一发现可能解释了在体组间每卵泡冲洗液用量无显著差异的原因，尽管单次冲洗组执行的冲洗次数少至九倍。凝块通过释放红细胞损害了过滤和搜索，增加了培养基的浑浊度。在凝块较多的情况下，操作者可能会花费更多时间搜索，并可能遗漏卵母细胞。因此，建议在过滤过程中将凝块转移到单独的培养皿中，以保持清晰的可见度。
本研究的主要限制是在体组样本量小以及抽吸的卵泡数量有限。由于描述的缺点，单次冲洗方法可能不适用于商业采卵系统。研究的第二个限制是缺乏体外胚胎生产结果，因为研究仅关注采卵程序相关的卵母细胞回收率和技术变量。据信，囊胚生产不应受到每组使用的冲洗次数的影响，因为两组使用的冲洗培养基类型相同。
未来的研究思路可能涉及持续低流速以最大限度地减少凝块形成，因为使用多次冲洗扩张卵泡或增加压力并未被证明能提高卵母细胞回收率。
5 结论
本研究表明，无论离体还是在体条件下，有效的卵泡刮擦对卵母细胞回收率均有影响，且无需多次冲洗。未来的研究需要定义一种优化的方法，以平衡刮擦时间与最少的冲洗，从而最大化卵母细胞回收率，最小化操作者疲劳，并减少系统堵塞和培养基用量。
