白千层提取物的保钾利尿作用：体内验证及通过分子对接技术揭示作用机理

《Scientific African》：Potassium-Sparing Diuretic Efficacy of Reseda alba Extract: In Vivo Validation and Mechanistic Insight via Molecular Docking

　　马鲁安·塔基 | 拉菲克·埃尔-梅尔尼西 | 多哈·纳吉 | 穆罕默德·阿明·埃尔·哈贾吉 | 莫斯塔法·梅斯基尼 | 阿明·穆纳迪·伊德里斯 | 萨拉赫-埃丁·舍贝比 | 卢赛因·哈贾 | 巴迪亚·卢伊西 | 艾哈迈德·萨米尔·本杰卢恩
摩洛哥菲斯大学西迪·穆罕默德·本·阿卜杜拉大学科学学院生物技术、生物资源保护与增值实验室

**摘要**
合成 Loop 利尿剂（如呋塞米）具有副作用，尤其是低钾血症。本研究探讨了白车前草（Reseda alba）水性提取物（RAE）的植物化学成分及其利尿活性，特别是在电解质平衡和肾脏保护方面的作用。植物化学成分通过 HPLC-DAD 方法测定。雄性 Wistar 大鼠（n=24）被分为对照组、呋塞米组（10 mg/kg）和提取物处理组（200 mg/kg 和 400 mg/kg）。利尿活性通过急性尿量（24 小时）和 20 天后的累积尿量进行评估。同时定量分析了血浆和尿液中的电解质（Na+、K+、Cl-）以及肾功能指标（尿素、肌酐）。此外，还进行了计算机模拟（分子对接）实验，以估计鉴定出的酚类化合物的结合亲和力和可能的利尿靶点。HPLC 分析显示提取物中含有十种酚类化合物，其中儿茶素（9.23%）、没食子酸（8.27%）和对香豆酸（7.31%）含量较高。在这两个剂量下，白车前草显著增加了体内尿量和钠的排泄。更重要的是，与导致严重低钾血症的呋塞米不同，该提取物未引起低钾血症。此外，血清尿素和肌酐水平保持在正常生理范围内，证明其没有肾毒性。白车前草具有与呋塞米相当的强大利尿活性，且安全性更好，即不会导致钾流失并保持肾功能完整。这些效应可能与其丰富的酚类化合物有关，表明其具有作为更安全药物的潜力。

**引言**
药用植物历来是含有多种治疗用途的生物活性化合物的主要来源。白车前草（Reseda alba），又称白米尼翁内特（white mignonette），是一种传统上用于草药的植物，因为它具有广泛的药理作用。白车前草原产于地中海地区，可作为抗菌、抗炎和抗氧化成分 [1]。人们对植物衍生利尿剂的兴趣日益增长，因为合成利尿剂与多种不良反应有关，如电解质失衡和代谢紊乱，因此需要更安全的替代品 [2,3]。在这种情况下，白车前草可能是开发天然利尿剂的一个有前景的来源。利尿植物在治疗高血压、充血性心力衰竭和肾脏疾病方面起着重要作用，因为它们能促进水分和电解质的排出 [4,5]。合成利尿剂（如噻嗪类）和 Loop 利尿剂（如呋塞米）常被用于治疗这些疾病，但存在一些限制，如钾丢失和肾毒性 [6]。因此，科学家们专注于发现副作用较少的植物来源利尿剂 [7]。白车前草中发现的某些生物活性化合物包括黄酮类、单宁和皂苷，并已被证实能通过影响肾功能和钠的排泄产生利尿效果 [8,9]。多项研究证实了白车前草的药理潜力，尤其是其抗氧化作用，这归因于其中高含量的酚类化合物 [1]。肾脏疾病的发展与氧化应激密切相关，具有高抗氧化活性的植物对于预防肾毒性至关重要 [10]。此外，白车前草还具有抗炎作用，这意味着它可能用于治疗肾脏炎症并增强利尿效果 [11,12]。尽管白车前草有传统应用，但其利尿效果和安全性尚未通过现代药理学模型进行仔细研究。因此，这项研究将是首次使用 Wistar 大鼠进行的全面体内和计算机模拟实验，以评估其利尿活性。首先，将比较该提取物与常用的 Loop 利尿剂呋塞米的疗效 [13,14]，并严格评估其对电解质平衡（尤其是钾）和肾脏完整性的影响。

**研究目的**
本研究旨在全面评估白车前草的利尿活性，包括其急性和慢性效应。将在选定的时间点（1、2、4、8、12 和 24 小时）测量尿量，以评估短期利尿反应，并在 20 天的治疗期间评估累积效应。此外，还将分析生化参数（肌酐、钠、钾和氯水平），以评估肾功能和电解质平衡。本研究旨在提供实验证据，支持白车前草作为植物基利尿剂的潜力，并促进具有较少副作用的天然治疗剂的开发。

**材料与方法**
**提取物制备**
2024 年 5 月从菲斯地区收集了白车前草样本（凭证号：RAB41004），并存放在摩洛哥菲斯大学西迪·穆罕默德·本·阿卜杜拉大学科学学院的生物技术、生物资源保护与增值实验室。随后使用水浸法提取植物粉末：每个样本（1 克）与 10 毫升蒸馏水混合，超声波处理 30 分钟，然后在受控的暗环境下空气干燥。整个提取过程持续一周。提取物通过 Whatman N°1 纸过滤后保存以备后续分析 [15]。

**HPLC 分析**
样品制备完成后，配制浓度为 30 mg/mL 的标准溶液，并使用 0.4 μm 过滤膜去除颗粒物。采用 HPLC-UV 系统，按照 Zefzoufi 等人的改进方法进行色谱分析 [16]。使用 250 × 4.6 mm、2.6 μm 颗粒大小的 Kinetex C18 反相柱进行分离。移动相由甲醇（溶剂 B）和 0.1% 醋酸水（溶剂 A）组成，梯度方案如下：3–6 分钟，5–25% B；3–6 分钟，25–37% B；6–9 分钟，25–37% B；9–13 分钟，37% B；13–18 分钟，37–54% B；18–22 分钟，54% B；22–26 分钟，54–95% B；26–29 分钟，95% B；29–35 分钟，95–5% B；35–45 分钟，5% B。色谱系统流速为每分钟 1 毫升，柱温保持在 30 摄氏度。色谱图在 280 nm 处观察，紫外-可见光谱区域（200–400 nm）进行检测。通过与真实标准的保留时间比较确定化合物身份。

**动物实验**
本实验使用了 24 只雄性 Wistar 大鼠（体重 204.06 ± 21.42 克）。这些大鼠饲养在菲斯大学动物设施中，提供充足的食物和自来水，室温为 25°C，光照和黑暗周期各为 12 小时。实验符合伦理动物护理和使用指南，并获得了菲斯大学科学学院伦理委员会的批准（注册号为 L.20. USMBA-SNAMOPEQ 2023–03）。采取了措施减少动物痛苦并尽量减少实验所用动物数量。

**实验设计**
每只大鼠在试验前在代谢笼中适应三天。大鼠随机分为四组，每组包含相同数量的雄性和雌性大鼠。对照组接受体重 10 mg/kg 的蒸馏水处理；第 2 组接受 10 mg/kg 的呋塞米；第 3 组接受 200 mg/kg 的 RAE；第 4 组接受 400 mg/kg 的 RAE（剂量高于第 3 组）。干预后，分别在用药后 1、2、4、8 和 24 小时收集尿液。所有组大鼠连续 20 天每天给药一次，期间收集尿液并记录 24 小时尿量。第 20 天分析尿液和血清样本中的电解质（钠、钾、氯）。还测量了血清尿素和肌酐以及尿液中的肌酐排泄量。此外，还检测了血浆和尿液的渗透压和自由水清除率。

**肾功能评估**
血浆样本通过眶后注射采集，并在戊巴比妥镇静下转入肝素化毛细管中。上清液在 3500 rpm 下离心 10 分钟后冷藏待后续分析 [17]。用于评估肾功能的参数包括：
- 尿素：尿液肌酐浓度
- 血浆肌酐浓度
- 尿量（ml/min）

**自由水清除率（T CH?O）**
自由水清除率通过以下公式计算：
TCH?O = ?[V × (Uosm / Posm)]
其中：
- V = 尿量
- Uosm = 尿液渗透压
- Posm = 血浆渗透压

**分子对接**
首先从 PubChem 数据库的 SDF 文件中获取 Calendula arvensis 中的所需植物化学成分，然后使用 Maestro 平台（Schrodinger Suite，版本 11.5）的 LigPrep 模块制备配体。使用 OPLS3 力场精炼每种化合物的几何结构，并将离子化状态调整至生理条件（pH 7.0 ± 2.0）。系统还生成每种化合物的最多 32 种立体异构形式以覆盖立体化学变体 [18,19]。

**蛋白质制备**
根据生物学重要性选择蛋白质靶点，并从 RCSB 蛋白质数据库（www.rcsb.org）中检索。特别选择盐皮质激素受体（MR，PDB ID：2OAX）来研究其潜在的利尿活性。通过添加氢原子、调整键序、去除晶体水分子和优化氢键相互作用等方式对蛋白质结构进行优化，再进行对接模拟。受体电荷状态也进行了优化，使用 OPLS3 力场进行能量最小化以确保构象稳定性 [20,21]。

**分子对接**
分子对接模拟采用 Maestro 平台（Schrodinger，版本 11.5）的 Glide 模块中的 Standard Precision（SP）协议进行。为了提高结果可靠性，对能量不利的酰胺取向进行了惩罚，并将配体的范德华半径减小到默认值的 80%。同时设置原子电荷截止值为 0.15 以增强非共价相互作用的处理。对接 Pose 的评估基于 Glide 评分算法，该算法结合了结合强度和空间兼容性。选择具有最低 Glide 评分的构象，即最稳定和最有利的结合形式 [22,23]。白花鼠尾草（Reseda alba）水提取物中酚类化合物的鉴定与测定

- 流行化合物 | 保留时间（分钟） | 面积百分比
- | ----------------------- | --------------------------- |
- 苹果酸 | 3.35 | 4.21 |
- 栀子酸 | 5.45 | 8.27 |
- 苯甲酸 | 7.68 | 0.34 |
- 卡基烯醇 | 8.50 | 9.23 |
- 樟脑酸 | 11.98 | 4.45 |
- 香草素 | 10.96 | 0.89 |
- 咖啡酸 | 11.55 | 0.10 |
- 对香豆酸 | 14.68 | 7.31 |
- 虎皮苷 | 27.28 | 6.85 |
- 栎皮素 | 30.38 | 4.96 |

**植物提取物对尿量的影响（按小时计算）**
尿流每小时进行评估，结果显示，在1至24小时期间，所有处理组的尿量都显著增加，与对照组相比（图2）。利尿效果在给药后的第一个小时就显现出来，并在整个观察期间逐渐增强。两种剂量的白花鼠尾草提取物都显著增加了尿量，其反应模式与参考利尿剂呋塞米相似。统计显著性表明，处理组与对照组在所有时间间隔内均有显著差异（p < 0.0001）。这些结果表明，植物提取物具有急性利尿作用，在给药后的最初几小时内即可观察到。

**植物提取物对尿量的影响（按天数计算）**
对接受白花鼠尾草提取物处理的动物进行20天治疗期间观察到的尿量持续增加（图3）。两种剂量（200毫克/千克和400毫克/千克）都使尿量逐渐增加，第20天时达到最大值。值得注意的是，提取物引起的尿量超出了呋塞米组。统计比较显示，在第1天和第20天，所有处理组之间都存在高度显著差异（p < 0.0001），表明利尿效果具有累积性。此外，在第20天，所有处理组的尿量都显著高于对照组（p < 0.0001）。这些发现表明，白花鼠尾草提取物具有长期和短期的利尿效果。

**植物提取物对血浆电解质的影响**
如图4所示，200毫克/千克和400毫克/千克剂量的水提取物给药并未显著改变血清钠（Na+）或氯（Cl-）浓度。然而，在钾（K+）的处理上观察到明显差异。与呋塞米组不同，后者钾含量降低了3.6倍，而提取物处理的动物保持了正常的钾水平。此外，尿素和肌酐水平的未显著变化表明，提取物的利尿作用不会损害肾脏功能。

**植物提取物对肌酐清除率的影响**
通过计算实验中所有组的肌酐清除率来评估慢性给药（20天）对肾小球滤过率的影响（图5）。呋塞米处理组的肌酐清除率显著增加（p < 0.05），这可能与合成利尿剂相关的肾滤过过程受损有关。相比之下，200毫克/千克（R200）和400毫克/千克（R400）剂量的白花鼠尾草水提取物的肌酐清除率分别为0.31±0.02 mL/min和0.32±0.03 mL/min。尽管这些值比对照组有所增加，但并未显著改变肌酐清除率或正常的肾血流动力学。此外，统计数据显示，R200和R400组的肌酐清除率远低于呋塞米组（p < 0.01）。

**呋塞米和白花鼠尾草提取物对电解质排泄和肾脏参数的影响**
呋塞米、R200（白花鼠尾草提取物，200毫克/千克）和R400（白花鼠尾草提取物，400毫克/千克）的给药均显著增加了Na+浓度和Na+利尿指数。R200组的Na+浓度最高，为368.5 ± 3.536 mmol/L，相应的Na+利尿指数为4.09 ± 0.113。R200和R400组的Na+浓度均高于呋塞米组。Cl-浓度在处理组之间也有所改善，R400组的最高值为815 ± 7.07 mmol/L。R400组的Cl-利尿指数最高，为3.36 ± 0.003，其次是R200，指数为2.14 ± 0.003。R200和R400组的Cl-浓度均高于呋塞米组。相比之下，呋塞米导致K+水平显著降低（219.5 ± 2.12 mmol/L vs 297.5 ± 3.53 mmol/L），使K+利尿指数降至最低（0.738 ± 0.011）。R200组的K+比值为1.43，标准误差为0.004。利尿活性的指标Lipchitz指数在R200组最高（2.97 ± 0.24）。R400组的肌酐水平（28.5 ± 0.7）显著高于对照组（14.45 ± 0.15）和呋塞米组（14.45 ± 0.15）。

**结论**
白花鼠尾草提取物具有长期和短期的利尿效果，对血浆电解质和肾脏功能有积极影响。它在不损害肾功能的情况下显著增加尿量和排泄物。此外，其利尿作用不受钾水平影响，而呋塞米会导致钾水平下降。计算机模拟研究表明，白花鼠尾草中的儿茶素、槲皮素和香草素是对抗盐皮质激素受体的最活跃分子。

**参考文献**
- 表2：呋塞米和植物提取物口服给药第20天对电解质排泄和肌酐的影响
- 表3：白花鼠尾草、呋塞米和蒸馏水对尿渗透压、血浆渗透压、渗透清除率和自由水清除率的影响
- 图1：不同白花鼠尾草提取物剂量组的尿液流速
- 图2：每日口服白花鼠尾草、呋塞米和蒸馏水后的尿量（24小时）
- 图3：20天治疗期间白花鼠尾草、呋塞米和蒸馏水的尿量产生
- 图4：白花鼠尾草提取物（200和400毫克/千克）对血浆电解质的影响

* 注：表格和图表中的数据仅供参考，具体研究细节和结果可能需要进一步验证。遵循El Ghouizi等人[26]和Bakour等人[27]的实验方案，我们在第20天对电解质进行了终末分析，以获得长期暴露后的确定稳态药理学特征。作用动力学表明，Reseda alba具有稳定的药代动力学特征，可用于长期治疗液体潴留[28]。值得注意的是，作为衡量利尿剂效力的标准指标的Lipchitz指数在200 mg/kg组达到了2.97的最高值，这证明了其相较于传统利尿剂具有较高的疗效[29]。本研究还发现Reseda alba的一个重要优势是其对电解质具有调节作用。人工髓袢利尿剂（如呋塞米）通过抑制Henle袢中的Na+/K+/2Cl–共转运体（NKCC2）来产生利尿效果，但这一过程不可避免地会导致钾的大量丢失（低钾血症）[30]。实际上，我们观察到使用呋塞米治疗后血浆钾水平显著下降。而使用Reseda alba的动物其血浆钾含量与对照组相似。此外，肾功能参数分析显示Reseda alba在治疗方面具有更优的优势，尤其是在预防心律失常方面，因为电解质稳定性尤为重要[31]。长期使用呋塞米会导致肌酐清除率显著降低（p < 0.05），这可能是由于血流动力学变化或直接作用于肾小管所致[32]。相反，使用Reseda alba治疗的动物组肌酐清除率明显高于呋塞米组（p < 0.01）。这种具有保护肾功能的效应被认为是由于其中含有多种保护肾脏成分的共同作用[33]。机制分析还涉及了自由水清除率的测定；CH2O值可以提供关于这一机制的重要信息。对照组自由水清除率为正值，而Reseda alba处理组的CH2O值为负值（其中R200组的值最低，为-4.8 μL/min）。负的自由水清除率表明该提取物能够抑制肾小管中溶质的重吸收，从而导致Na+和Cl-的排泄（即泌尿钠排泄），而不仅仅是单纯的水分排泄[34]。这与处理组尿液中的钠和氯化物排泄量显著增加的结果一致。为进一步解释这一现象，我们的计算机模拟实验聚焦于盐皮质激素受体（MR），该受体在调节远端肾小管中的钠重吸收和钾分泌中起关键作用。抑制MR可以阻断醛固酮介导的信号传导，从而减少钠通道的表达，进而减弱钾的流失，增强保钾效果。对Reseda alba中主要酚类化合物（如儿茶素、槲皮素和香兰素）的分子对接研究表明，它们与MR具有很强的结合亲和力（Glide GScores分别为-10.000、-9.145和-7.134 kcal/mol）。尤其是儿茶素的高亲和力表明其结合方式较为稳定，可能有助于抑制受体活性。与导致严重低钾血症的传统髓袢利尿剂（如呋塞米）不同，这些酚类化合物与MR的结合能力为Reseda alba的利尿作用提供了机制解释，同时不会干扰钾平衡。因此，这种提取物的利尿作用可能至少部分是通过其作为天然盐皮质激素受体拮抗剂的机制实现的。除了利尿作用外，Reseda alba还含有丰富的酚类化合物，如儿茶素、没食子酸、芦丁和槲皮素。氧化应激是导致肾脏损伤和高血压的主要因素之一[35]。这些化合物的抗氧化特性也已被广泛认可；研究表明芦丁和儿茶素能够保护肾脏组织免受缺血和氧化损伤[36,37]。与仅调节体液量的合成利尿剂不同，Reseda alba不仅通过利尿作用调节体内液体平衡，还通过其酚类抗氧化剂缓解氧化应激[38,39]。这种综合治疗效果在慢性肾病（CKD）和高血压等氧化应激为主的疾病中尤其有益[40]。这些发现对于医疗服务的可持续性和可及性具有重要意义。Reseda alba这种植物原产于地中海地区，来源丰富且价格低廉，是生物活性化合物的理想来源[41]。总体而言，本文认为Reseda alba是一种有效的天然利尿剂，其利尿机制可能是通过拮抗盐皮质激素受体实现的。与传统的髓袢利尿剂相比，它能够更好地保留钾并维持肌酐清除率，这是其重要的安全优势[42]。此外，其中所含的生物活性酚类化合物还具有抗氧化作用，表明Reseda alba可以作为一种功能性成分或植物药用于治疗液体潴留和肾脏健康问题[43]。

作者贡献声明：
- Marouane Takie：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、实验设计、资源管理、结果验证、数据可视化、初稿撰写及审稿编辑。
- Rafik El-Mernissi：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、实验设计、结果验证、数据可视化、审稿编辑。
- Doha Naji：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、项目管理工作、软件应用、结果验证、数据可视化、审稿编辑。
- Mohamed Amine El Hajjaji：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、实验设计、软件应用、结果验证、数据可视化、审稿编辑。
- Mostafa Messkini：概念构思、研究方法、结果验证、数据可视化、审稿编辑。
- Amine Mounadi Idrissi：概念构思、数据整理、资金筹集、研究方法、项目管理工作、资源管理、实验监督、结果验证、数据可视化。
- Salah-Eddine Chebaibi：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、资源管理、实验监督、结果验证、数据可视化。
- Lhoussain Hajji：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、资源管理、实验监督、结果验证、数据可视化。
- Badiaa Lyoussi：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、资源管理、实验监督、结果验证、数据可视化。
- Ahmed Samir Benjelloun：概念构思、数据整理、数据分析、研究方法、资源管理、实验监督、结果验证、数据可视化。