快速且超灵敏的荧光和比色检测方法用于原胺的检测，以及人工尿液中胰蛋白酶活性的监测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Rapid and ultrasensitive fluorescence and colorimetric detection of protamine and monitoring of trypsin activity in artificial urine

本研究采用商用荧光探针 eosin Y（EY）构建高效探针系统，通过静电组装实现 protamine 的荧光淬灭检测（检测限4.03 ng/mL），并开发智能手机平台进行可视化分析。当存在 trypsin 时，protamine 水解导致复合物解离，荧光恢复，实现 trypsin 活性监测，在生物医学检测中具有潜在应用价值。

　　

余柳|龚莉薇|应峰|徐宝才|李钊

北京工商大学轻工学院，中国北京102448

摘要

开发适用于检测白蛋白和胰蛋白酶的荧光传感系统具有重要的实际价值，因为这两种物质在生理和医疗过程中起着至关重要的作用。使用市售荧光探针是一种优选方案，因为它们具有方便性和无需复杂合成的优势。因此，基于市售荧光探针的传感系统的开发值得进一步研究。在本研究中，通过使用市售染料伊红Y（EY）作为探针，实现了对白蛋白的高效检测。在伊红Y与白蛋白发生静电结合后，观察到显著的荧光淬灭现象。同时，吸收光谱也发生了显著变化，溶液颜色从黄绿色变为粉红色。实验确认伊红Y是一种有效的白蛋白荧光检测探针，其检测限为4.03 ng/mL。为了实现白蛋白在缓冲溶液中的快速灵敏检测，开发了一种基于智能手机的荧光比色分析平台。此外，当存在胰蛋白酶时，白蛋白的水解会导致伊红Y-白蛋白复合物逐渐解离为伊红Y单体，从而在缓冲溶液和人工尿液中直接产生高灵敏度的信号。基于伊红Y的传感系统能够实现胰蛋白酶活性的连续实时监测和白蛋白的可视化检测，在临床诊断和药物发现领域具有巨大潜力。这项工作也为进一步研究奠定了基础，特别是探索基于其他荧光染料的检测系统。

引言

白蛋白含有约67%的精氨酸残基，这使其具有较大的阳离子表面电荷，分子量约为4.3 kDa [1]、[2]、[3]。该药物的主要功能是中和肝素的抗凝血作用 [4]、[5]。最近的研究表明，过量使用白蛋白可能会导致严重的不良反应，包括肺动脉高压和血小板减少症，并且个体间的代谢存在显著差异 [6]、[7]。此外，作为胰岛素缓释剂用于糖尿病治疗的白蛋白剂量精度直接影响治疗效果 [8]。综上所述，迫切需要开发高灵敏度的即时白蛋白检测技术。传统的蛋白质检测方法（如紫外-可见光谱法）由于白蛋白仅由脂肪族氨基酸组成而无法有效检测其存在 [9]。已经开发了几种白蛋白检测方法，包括电化学检测 [10]、质谱法（MS）[11] 和高效液相色谱法（HPLC）[12]，但这些方法存在一定的局限性，限制了其实际应用。因此，亟需快速、简便的白蛋白检测方法，如荧光测定法。

胰蛋白酶是胰腺腺泡细胞产生的最重要的消化酶之一，其特异性功能是分解含有碱性氨基酸（如精氨酸和赖氨酸）的肽键 [13]。在生理和病理过程中，胰蛋白酶发挥着多方面的作用。研究表明，血液中的胰蛋白酶水平可以作为诊断工具，用于区分囊性纤维化患者、急性胰腺炎患者、胰腺移植后患者以及健康个体 [14]、[15]。因此，监测胰蛋白酶活性在生物医学应用中至关重要。传统的胰蛋白酶检测方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[16]、表面增强拉曼散射（SERS）[17] 和凝胶电泳 [18]。近年来，基于荧光探针的荧光测定方法已得到广泛应用和发展 [19]、[20]、[21]。

基于荧光探针的荧光检测方法因其快速响应时间、高选择性、良好的可靠性和可视化能力而受到广泛关注 [22]、[23]、[24]、[25]、[26]。阴离子探针与白蛋白之间的静电相互作用会导致荧光发射的变化，这种变化与白蛋白浓度呈定量关系。尽管已有许多关于白蛋白荧光探针的研究报告 [27]、[28]、[29]，但仍存在一些不足之处，如灵敏度和选择性不够。例如，阴离子蛋白或金属离子的存在会导致假阳性信号 [30]。因此，亟需开发操作简便、高灵敏度且选择性的白蛋白检测探针。此外，由于白蛋白可被胰蛋白酶切割，向静电结合的探针-白蛋白系统中加入胰蛋白酶可恢复荧光 [31]，这一现象可用于监测胰蛋白酶活性 [19]、[32]、[33]、[34]。因此，开发适用于白蛋白和胰蛋白酶的高灵敏度选择性传感系统的合适荧光探针具有重要的实际价值。其中，市售荧光探针因其合成简单、成本低廉且无需复杂纯化过程而成为构建探针检测系统的首选。

在本研究中，选择了一种阴离子荧光染料伊红Y（EY）用于水介质中的白蛋白检测，并可进一步通过荧光方式监测胰蛋白酶活性。伊红Y主要用于生产红色油墨、红色铅笔以及羊毛、丝绸和尼龙织物的染色。此外，它还用作生物染色剂和化妆品口红中的着色剂（但禁止用于眼部周围）。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2017年致癌物清单，伊红Y被归类为3类致癌物，表示其安全性相对较低。伊红Y可通过荧光素的溴化或邻苯二酚缩合的溴化和盐形成反应合成，合成路线相对简单且易于获取。

已证实伊红Y在HEPES缓冲液中与白蛋白静电结合后会发出绿色荧光，随后荧光会被淬灭（图1）。基于荧光测定的结果显示，伊红Y对白蛋白的检测限（LOD）低至4.03 ng/mL，检测范围为0至7 μg/mL。此外，伊红Y对白蛋白还存在比色响应，从而提供了另一种白蛋白检测方法。在胰蛋白酶存在的情况下，白蛋白会被水解，导致伊红Y荧光恢复。这种荧光恢复现象可直接用于胰蛋白酶的检测，在HEPES溶液和10%人工尿液中均表现出良好的选择性和灵敏度。本研究为白蛋白检测及后续胰蛋白酶活性监测奠定了基础。

材料

白蛋白、伊红Y（EY）、溶菌酶（14.4 kDa）、卵清蛋白（44.5 kDa）、血红蛋白（64.5 kDa）和维生素C（VC）由中国Macklin公司提供。大豆来源的胰蛋白酶抑制剂和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）由中国MREDA公司提供。胎牛血清（FBS）来自以色列Biological Industries公司。牛血清白蛋白（BSA，66.4 kDa）和胰蛋白酶由中国Yuanye Biotechnology公司提供。所有其他试剂均为分析级。

伊红Y对白蛋白的光谱响应

研究表明，伊红Y具有静电结合特性。这种相互作用可导致荧光淬灭，有助于白蛋白的定量分析。为了验证这一策略，在HEPES缓冲液（10 mM，pH 7.4）中加入不同浓度的白蛋白（0–8 μg/mL）后，测得了伊红Y（10 μM）的稳态荧光光谱。

如图1a所示，游离的伊红Y显示出强烈的荧光，峰值波长为

结论

总结来说，建立了一个用于检测白蛋白和胰蛋白酶的传感平台。该平台使用市售的阴离子荧光染料伊红Y（EY）作为荧光探针，通过比色和荧光测定法实现白蛋白的高效检测。此外，还开发了一种基于智能手机的荧光比色分析平台，以实现白蛋白的快速灵敏检测。传感机制依赖于伊红Y-白蛋白复合物的形成。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家重点研发计划（2017YFB0308701）和北京市属高校高水平教师支持计划（CIT&TCD201804026）的支持。