第二代TBBA的合成及其在氨基酸和寡肽的手性分析中的应用——基于1H和19F核磁共振光谱技术

《The Journal of Organic Chemistry》：Second-Generation Synthesis and Analytical Application of TBBA for Chiral Analysis of Amino Acids and Oligopeptides by 1H and 19F NMR Spectroscopy

　　大卫·普罗福斯（David Profous）|娜杰日达·坎卡罗娃（Nadě?da Canka?ová）|雅各布·恩恩格尔（Jakob Enengl）|萨林·索吉（Sarin Soji）|乌韦·里纳（Uwe Rinner）|彼得·尤雷奇卡（Petr Jure?ka）|彼得·坎卡罗娃（Petr Canka?）
捷克共和国奥洛穆茨帕拉茨基大学（Palacky University Olomouc）科学学院有机化学系，邮编48207

我们开发了一种简洁高效的第二代合成方法，用于制备2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)苯甲酸（TBBA）。通过形成非对映异构盐并利用光学拆分技术，该方法能够显著提高TBBA的纯度，实现了对映体纯度的显著提升，从而能够在32毫摩尔的规模上进行制备。此外，还证明了TBBA作为手性衍生化试剂在氨基酸衍生物固相合成中的适用性，通过1H和19F核磁共振（NMR）光谱技术可以确定其绝对构型和光学纯度。甚至可以在低场台式NMR光谱仪上对样品（溶解在非氘代溶剂中）进行19F NMR分析。

**引言**
氨基酸和肽的立体化学完整性对其生物活性和功能至关重要。1963年罗伯特·布鲁斯·梅里菲尔德（Robert Bruce Merrifield）发现的固相肽合成（SPPS）彻底改变了肽化学领域，使得高纯度肽的合成变得高效且可重复。尽管SPPS技术取得了显著进展，但碱或试剂引起的消旋现象仍然是一个持续存在的挑战，这常常会导致不需要的立体异构体的形成，从而影响最终肽的生物性质。当带有亲核侧链（如组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸）的氨基酸被偶联试剂活化时，会形成容易发生消旋的中间体，进而导致肽键形成过程中的α-碳原子构象变化。这些消旋产物难以通过常规纯化方法去除，这使得达到所需的立体化学纯度变得复杂。为了准确评估和控制合成氨基酸衍生物的立体化学结果，开发可靠的分析方法以确定其光学纯度和绝对构型至关重要。为此，可以采用手性高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）、圆二色性（CD）、毛细管电泳（CE）以及核磁共振（NMR）等技术。其中，手性HPLC是最常用的技术，被广泛认为是确定对映体纯度的金标准。通常，色谱分离需要真实的标准品来明确评估样品的质量和数量；当这些标准品无法商业购买时，往往需要自行合成。由氨基酸衍生的化合物在结构上的相似性给开发高效且选择性的分离方法带来了挑战。如果氨基酸、寡肽或小肽衍生物仅含有弱紫外活性的发色团，使用传统的紫外（UV）检测方法会进一步加剧分析难度。

**19F NMR光谱在氨基酸衍生物分析中的应用**
在19F NMR光谱中应用手性19F标记探针为评估通过SPPS制备的衍生物的化学和立体化学纯度提供了一种有吸引力的替代方法。19F NMR光谱的优势在于其对电子环境的极高敏感性，即使在低浓度下也能检测到细微的结构或电子变化，并且具有出色的信噪比。大多数分析物和基质中不存在内源性氟核，这一特点在生物分子研究中尤为有利。我们最近报道了一种利用手性衍生化试剂2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)苯甲酸（TBBA）通过19F NMR光谱确定伯胺和仲醇绝对构型的方法。基于这些发现，我们希望扩展TBBA的应用范围，用于确定通过SPPS合成的氨基酸衍生物的绝对构型和立体化学纯度。我们设想这种方法将能够通过19F NMR（必要时结合1H NMR）验证N端氨基酸的构型。由于TBBA衍生物的19F NMR谱通常显示出对应于三氟甲基的尖锐单峰，因此该方法可以直接评估立体化学纯度，而在1H NMR谱中由于结构相似基团的共振峰重叠，这一评估过程较为复杂。我们还使用无需低温冷却的台式NMR光谱仪验证了该方法的初步适用性，这些仪器非常适合常规实验室使用。台式NMR仪器的另一个优点是可以在19F NMR实验中使用非氘代溶剂。

**结果与讨论**
TBBA的第二代合成遵循先前报道的程序进行，改进了反应条件和后处理步骤，并扩大到32毫摩尔的规模。反应过程首先通过亲核芳香取代反应生成苯甲酸2（来自邻氨基苯甲酸和氟苯1），随后通过催化氢化生成二胺3，再进一步环化得到外消旋的TBBA（rac-4）。所得外消旋体经过结晶处理以确保均匀性和纯度，之后通过形成非对映异构盐进行光学拆分（图1）。

**TBBA寡肽衍生物的制备**
我们采用标准固相合成方法制备了TBBA寡肽衍生物（图2）。首先用50%哌啶在DMF中处理Rink酰胺树脂5以去除Fmoc保护基团，随后在标准偶联条件下与Fmoc保护的氨基酸进行酰化反应，重复此步骤直至获得所需的寡肽序列6。最终通过Fmoc脱保护后与TBBA反应生成化合物7，并从树脂上分离出来。与先前报道的方法相比，新方法具有更大的规模、更短的处理时间、更低的成本、更简单的操作流程以及更少的废物产生。

**结论**
我们开发了一种通过光学拆分非对映异构盐（通过形成非对映异构盐）来制备纯度高、轴手性的TBBA的第二代合成方法，显著简化了原有方法中耗时且劳动密集型的色谱分离步骤。

**总结**
本文介绍了一种高效的第二代TBBA合成方法，实现了对映体纯度的显著提升，并展示了其在氨基酸衍生物分析中的应用潜力。这种方法有望通过19F NMR（可选结合1H NMR）验证N端氨基酸的构型。由于TBBA衍生物的19F NMR谱中三氟甲基峰非常明显，因此可以直接评估立体化学纯度。我们还使用台式NMR光谱仪验证了该方法的可行性，这些仪器无需低温冷却，适合常规实验室使用。此外，该方法允许在19F NMR实验中使用非氘代溶剂。相比之下，组氨酸16的ΔδPM值显著下降至-0.03 ppm（针对CH2基团），同时ΔCF3值上升至+0.1 ppm。含有羟甲基的分子可能存在问题，因为羟基部分可能与TBBA酰胺的羰基形成分子内氢键，从而使得构象平衡偏离一般模型。丝氨酸17的CH2基团的ΔδPM值为-0.27 ppm，在所研究的衍生物中排名第二，而ΔCF3值为+0.08 ppm。CH2基团的最高ΔδPM值出现在天冬氨酸甲酯18中（-0.33 ppm）。天冬酰胺19的ΔδPM值较低，为-0.19 ppm。有趣的是，这两种氨基酸的ΔCF3值相似，天冬氨酸18为+0.14 ppm，天冬酰胺19为+0.12 ppm。总体而言，在DMSO-d 6中获得的ΔδPM值（图3）与所提出的该溶剂的通用构象模型（图1B）一致。ΔCF3值也与图1D中的模型一致，只有缬氨酸衍生物10出现了一个例外，显示出负差异。然而，同时通过1H NMR光谱获得的ΔδPM值支持了这一看似矛盾的结果。绝对ΔCF3值的范围在0.02至0.18 ppm之间，只有酪氨酸14的值对于在80 MHz下运行的台式NMR光谱仪来说太小而无法可靠分辨。为了确定立体异构混合物的对映体或非对映体纯度，需要至少4 Hz（0.05 ppm）的差异。我们进一步筛选了多种未氘代的溶剂用于台式NMR，以找到能够产生较大ΔCF3值的溶剂。在这些未氘代的溶剂中，四氢呋喃（THF）提供了最显著的ΔCF3值。我们假设这些非对映体氨基酸酰胺对会采用与CDCl3中先前描述的模型一致的构象（图1C）。作为模型化合物的丙氨酸9支持了这一假设，其ΔCF3值为-0.10 ppm。缬氨酸10的ΔCF3值更大，为-0.34 ppm，远高于DMSO-d 6中的值。亮氨酸11和甲硫氨酸12的ΔCF3值略低于缬氨酸10（分别为-0.24 ppm和-0.22 ppm），但这些值仍然高于DMSO-d 6中的测量值。芳香族氨基酸在THF中的ΔCF3值低于脂肪族氨基酸，尽管这些值仍显著高于DMSO-d 6中的值。苯丙氨酸13的ΔCF3值为-0.12 ppm，而酪氨酸14和色氨酸15的ΔCF3值均为-0.15 ppm。相比之下，组氨酸16是唯一一个显示出异常ΔCF3值（+0.07 ppm）的化合物，这可能是由于形成了一个竞争性的分子内氢键，导致构象平衡偏离图1C中描绘的一般构象模型。丝氨酸17在THF中的ΔCF3值低于DMSO-d 6中的值，为-0.05 ppm。有趣的是，天冬氨酸甲酯18和天冬酰胺19在THF和DMSO-d 6中的ΔCF3值几乎相同。使用THF通常会增加19F NMR光谱中的ΔCF3差异，这对于旨在确定立体异构比例和分配绝对构型的低场台式NMR测量特别有利。尽管如此，THF对各种氨基酸衍生物的溶解度范围比DMSO更窄。在完成了对单个氨基酸酰胺的研究（图3）后，我们将研究扩展到结构相关的二肽和一种三肽（图4）。这一步骤旨在验证即使在光谱解释可能因信号重叠而复杂的情况下，TBBA的应用是否仍然适合于确定N端氨基酸的绝对构型。下载：下载高分辨率图像（207KB）下载：下载全尺寸图像。4. TBBA肽酰胺非对映体1H NMR光谱中β-质子的化学位移差异（ΔδPM）。这些值是根据公式ΔδPM = δL(P) – δL(M)计算得出的。19F NMR光谱中的差异表示为ΔCF3（DMSO-d 6用黑色表示；THF用蓝色表示），以CFCl3作为内标。化学位移差异计算为ΔCF3 = δCF3 19F(P) – δCF3 19F(M)。异常值用下划线标出。分析的α-手性位置用星号表示。利用通过1H NMR和19F NMR分析单个氨基酸的既定模型（图1），我们首先研究了二肽(l)-Ala-(l)-Ala 20（图4）。在DMSO-d 6中，该二肽在1H NMR光谱中的ΔδPM值为-0.20 ppm，与之前观察到的丙氨酸衍生物9的行为一致。相比之下，19F NMR光谱显示ΔCF3值降低至+0.12 ppm，仅为单个氨基酸衍生物检测到的值的三分之二。为了评估绝对构型对Ala-Phe二肽中化学位移差异的影响，我们在DMSO-d 6中分析了(l)-Ala-(l)-Phe 21和(l)-Ala-(d)-Phe 22。观察到的ΔδPM值几乎相同（分别为-0.26 ppm和-0.25 ppm），表明苯丙氨酸手性中心的反转对靠近手性探针的质子环境只有轻微影响。相比之下，19F NMR光谱中检测到了更明显的差异。(l)-Ala-(l)-Phe 21的ΔCF3值为+0.16 ppm，而(l)-Ala-(d)-Phe 22的ΔCF3值增加至+0.22 ppm。相应的(d)-Ala-(l)-Phe非对映体23再次显示出相似的ΔδPM值+0.26 ppm，伴随ΔCF3值为-0.21 ppm，这与预期相反构型的行为一致。重要的是，苯丙氨酸构型的变化并未改变ΔCF3的符号，从而能够正确分配二肽21-23的N端氨基酸的绝对构型。当反转氨基酸序列时，二肽(l)-Phe-(l)-Ala 24的ΔδPM值降低至-0.10 ppm，低于之前的Ala-Phe二肽。值得注意的是，ΔCF3值-0.04 ppm显得异常，与预测的构象模型（图1D）不符。这个异常值可能是由于苯环的构象产生了更强的屏蔽效应，这种效应受到C端丙氨酸的增强。二肽(l)-Ser-(l)-Phe 25的ΔδPM值为-0.32 ppm，高于丝氨酸衍生物17的测量值。相应的ΔCF3值降至+0.04 ppm，低于丝氨酸17的值。三肽(l)-Ala-(l)-Ala-(l)-Ala 26的差异与单体丙氨酸9和二肽(l)-Ala-(l)-Ala 20观察到的差异非常相似。具体来说，ΔδPM值为-0.19 ppm，而ΔCF3值为+0.14 ppm，两者都与提出的构象模型一致。在THF中，二肽和三肽的绝对ΔCF3值在大多数情况下都低于DMSO-d 6和单个氨基酸（图3）中的值。(l)-Ala-(l)-Ala 20在THF中的差异与DMSO-d 6中的几乎相同，为-0.10 ppm。(l)-Ala-(l)-Phe 21的ΔCF3值为-0.04 ppm，而(l)-Ala-(d)-Phe 22的ΔCF3值略低（-0.03 ppm）。这两个值都显著低于DMSO-d 6中的值。此外，(d)-Ala-(l)-Phe 23的ΔCF3值比其非对映体更小，为-0.01 ppm，这与THF溶液中的提出构象模型（图1C）不符。(l)-Phe-(l)-Ala 24在THF中的ΔCF3值最高（-0.16 ppm），在合成的寡肽中。对于(l)-Ser-(l)-Phe 25，THF中的ΔCF3值降至-0.06 ppm。三肽26的ΔCF3值为-0.04 ppm，也低于DMSO-d 6中的相应值。总体而言，图4中展示的寡肽研究证明了通过1H NMR光谱（ΔδPM差异）可以可靠地分配N端氨基酸的绝对构型。使用19F NMR光谱也是可行的；然而，在DMSO-d 6中观察到一个异常值（二肽24），在THF中观察到另一个异常值（二肽23）。尽管如此，这些偏差可以通过1H NMR光谱的补充分析来解决。此外，即使在第二个手性中心远离TBBA基团的情况下，也可以确定N端氨基酸的绝对构型。此外，用TBBA衍生寡肽还可以通过19F NMR光谱确定光学纯度。研究表明，对应于三氟甲基的单峰（见图4中的括号中的化学位移）可以在结构相似的二肽21-24混合物中分辨出来，即使使用400 MHz NMR仪器，在某些情况下，甚至使用台式80 MHz NMR光谱仪也可以实现。19F NMR信号的分离程度还可以通过选择(P)-或(M)-TBBA试剂和所用溶剂来调节。总之，开发了第二代TBBA合成方法，显著简化了整个过程，并通过形成非对映体盐实现了对映体纯度的光学分离。该过程成功扩大到32 mmol批次规模，提供了一种操作简单、成本效益高且可重复的路线。TBBA在SPPS中的首次应用表明，这种手性衍生剂可以通过1H和19F NMR光谱有效用于确定氨基酸和寡肽的绝对构型和立体化学纯度。由于氨基酸衍生物在CDCl3中的溶解度有限，因此提出了一个修改后的通用构象模型，以解释在极性溶剂DMSO-d 6中观察到的酰胺基团的溶剂诱导构象变化。通过1H NMR光谱发现N端氨基酸的绝对构型分配是可靠的，而19F NMR光谱提供了补充信息，仅在DMSO-d 6和THF中研究的18个衍生物中有两个例外。在这些情况下，结合分析1H和19F NMR光谱解决了差异。19F NMR分析TBBA衍生物的主要优势在于它能够监测结构相似的立体异构体的立体化学纯度，因为与1H NMR相比，19F NMR具有更宽的化学位移范围，而1H NMR中的信号重叠通常限制了准确性。总体而言，使用TBBA作为通过固相方法合成的氨基酸和肽衍生物的手性衍生剂，代表了基于NMR的强大替代传统色谱技术的方法。此外，台式19F NMR仪器的可用性进一步扩展了这种方法的实用性和可访问性。