综述：利用Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性加氧酶实现可持续合成

《Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry》：Harnessing Fe(II)/α-ketoglutarate-dependent oxygenases for sustainable synthesis

这篇综述系统阐述了Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性加氧酶(αKG OXs)作为可持续生物催化合成关键工具的最新进展。文章重点介绍了数据驱动和机器学习(ML)指导的酶发现与工程、基于金属中心和活性位点工程实现的“非天然”反应性重编程，以及这些酶在化学酶级联合成复杂天然产物和药物中间体中的应用，展现了其在绿色合成化学中的巨大潜力。

　　

机器学习(ML)辅助与数据驱动的酶发现和工程

数据驱动策略正在重新定义酶的发现和工程，机器学习(ML)成为超越传统筛选极限、识别和优化生物催化剂的强大驱动力。通过将高通量实验与预测模型结合，ML指导的方法能够快速绘制酶-底物关系图谱，并理性地提高催化活性。Narayan及其同事报道了一种创新策略，他们构建了一个包含314种αKG OXs的高度多样化酶库，对111种结构多样的小分子底物进行了96孔板反应筛选，发现了215种新的酶-底物反应。结合实验与文献数据建立的BioCatSet1数据集，用于训练两种梯度增强排序模型（底物到酶预测和酶到底物预测），并集成于开放访问的网络平台CATNIP中。利用该平台，研究人员发现了新的αKG OX催化生物转化，例如NHI304催化(-)-鹰爪豆碱(19)羟基化生成20（产率35%），以及NHI091催化6-亚甲基雄甾-4-烯-3,17-二酮(21)氧化生成22（产率12%），后者代表了αKG OX催化氧化烯烃裂解的首个例子。

另一项研究展示了ML引导的酶工程如何揭示先前难以获得的酶活性。为了提高对非天然底物环己烷羧酸(23)生成反式-4-羟基环己烷羧酸(24)的催化效率，并解决反式-4-脯氨酸羟化酶(tP4H)稳定性与溶解性差的问题，研究人员应用深度学习模型ProteinMPNN来重新设计αKG OX骨架以提高稳定性，同时保持催化能力。在大约70%基于高ProteinMPNN置信度评分和良好结构指标筛选的变异体中，R2_11在保留其天然氧化活性的同时，热稳定性提高了11°C。基于R2_11变体进行的进一步定向进化，使其周转数(TON)比R2_11提高了80倍。

此外，结合计算酶工程的数据驱动分析流程也被证明在发现罕见的αKG OX反应性方面非常强大。对Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性卤化酶WelO5^*的研究表明，高通量数据的计算分析可以揭示先前难以获得的反应路径并指导聚焦式酶优化。研究人员开发了专为生物催化实验高分辨率LC-MS分析定制的基于Python的流程EnzyMS，并系统性地重新分析了其内部WelO5^*变体库与大环内酯类抗生素沙那芬A(25)的反应。EnzyMS能够检测到意想不到的氧化反应，特别是选择性氧化去甲基化反应。基于这些发现，研究人员应用了基于结构的计算设计策略，在一组经过预测的少量变体中，鉴定出多种WelO5^*突变体，其去甲基化性能提高了三倍，同时很大程度上抑制了竞争的羟基化和卤化途径。

重编程酶实现“非天然”转化

除了通过Fe^IV=O物种进行的天然氧化化学，αKG OXs正被重新定位为“非天然”反应性的通用平台。通过对其金属辅因子和活性位点环境进行重新设计，最近的研究表明，这种酶结构可以被重新编程，以介导非生物和氧化还原中性的反应。通过工程化典型的2-组氨酸-1-羧酸盐(2H1C)配位基序（通常朝向类卤化酶的一级配位球），研究人员已将这类酶的活性导向机制截然不同的反应性。

这种机制重编程的一个代表性例子是αKG OXs DiOH和Hneap催化的氧化还原中性Mukaiyama水合反应。与依赖αKG和分子氧生成铁酰物种进行氧原子转移的传统αKG OX化学不同，该酶与苯乙烯衍生物32在Fe(II)或Fe(III)以及还原剂NaBH₄存在下的反应无需αKG即可高效进行，实现了约3000次周转(TON)。机理分析表明，DiOH和Hneap通过氢原子转移(HAT)途径介导烯烃水合。在此机制中，源自NaBH₄的氢原子被转移到烯烃上生成碳中心自由基。酶结合的铁中心稳定该自由基并促进其与Fe(III)-超氧物种重组，生成Fe(II)-烷基过氧中间体，随后分解产生马氏规则选择性的醇产物。该反应确立了αKG OX骨架可以通过HAT途径维持自由基介导的非氧化催化，从而扩展了其用于非生物转化的反应性景观。

重新编程经典的2H1C面部三齿配位基序本身能够解锁αKG OXs的“非天然”反应性。一个里程碑式的例子是通过定向进化将αKG OX SadA改造用于未活化脂肪族氨基酸或氨基底物的位点选择性C-H键叠氮化。面部三齿配位中保守的天冬氨酸残基的突变(D157G)创造了一个类卤化酶的配位环境，随后的迭代定向进化产生了工程化变体4-IC，其优先促进叠氮自由基反弹而非羟基反弹（叠氮化与羟基化的平均选择性比为3.7:1）。机理和计算分析表明，这种化学选择性并非源于金属中心本身的变化，而是源于整个酶中分布的结构变化共同控制了Fe(IV)(oxo)(N₃)中间体的反弹选择性。

基于仅通过2H1C工程即可实现“非天然”自由基反弹化学的能力，第一配位球内的金属替代已成为引入非天然催化功能的另一强大策略。在αKG OX SadA中，用铜替换天然的铁中心，将酶转化为对映选择性路易斯酸生物催化剂。定向进化结合荧光点击化学筛选平台进一步产生了一个变体SadA-ene，能够以高达99%对映体过量(e.e.)、99%产率和250总周转数(TTN)促进不对称Conia-烯环化反应。光谱和机理分析表明，Cu(II)同时配位可烯醇化的羰基和炔基部分，通过双重活化促进C-C键形成。

除了静态金属替换，光活化也被用于扩展该酶家族的催化谱。在乙烯形成酶PsEFE中，用镍替代铁并设计双齿2-组氨酸配位环境，实现了光诱导的配体到金属电荷转移(LMCT)化学，支持Ni(II)/Ni(I)/Ni(III)催化循环。在此机制中，Ni(II)-硫醇盐复合物的光激发诱导LMCT，产生硫基自由基和Ni(I)物种。硫基自由基随后与通过氧化加成形成的Ni(III)-芳基中间体重组，从而实现高效的C-S键形成。在可见光照射下，重新设计的酶催化芳基溴化物与硫醇之间的C(sp²)-S交叉偶联，以高达98%的产率和530 TTN得到硫醚。

化学酶级联合成

在生物催化和合成化学的交叉领域，αKG OXs通过选择性C-H氧化正在改变复杂分子的构建。它们精确的区域和立体选择性功能化的能力越来越多地应用于化学酶级联合成。

参与aculene生物合成的多功能αKG OX AneA是该酶家族催化多样性的例证。它在多种倍半萜骨架上同时执行羟基化和去饱和作用，生成aculene A(42)和feruginin(43)的关键前体。反应模式由底物结构决定。这种双重反应性为萜类骨架的顺序氧化去对称化和后期多样化提供了一个多功能平台。值得注意的是，单个突变(D136G)即可将AneA转化为以meso-环己醇为底物的叠氮化生物催化剂，凸显了其向非天然C-H键功能化方向进化的潜力。

参与anditomin生物合成的αKG OX AndA，通过定向进化和文库筛选，被重新编程用于9,11-脱氢硬尾醇内酯(44)多个位置（C1, C2, C3, C5, C6）的位点选择性羟基化。将工程化的AndA变体与化学氧化相结合，实现了印楝素(48)及其相关半日花烷二萜的简洁、无保护基合成，展示了化学酶氧化级联在复杂分子组装中的力量。这项工作代表了酶引导氧化图谱构建的范式，将惰性的萜类骨架转化为密集功能化的中间体。

在制药生产中，工程化的αKG OXs已被部署用于以单步生物转化替代多步骤化学氧化。进化后的FoPip4H变体(Rd16BB)以>15,000 TON和>99% e.e.催化哌可酸衍生物49的反式-C4羟基化，在公斤级规模上为抗癌药物贝组替凡(51)提供了关键中间体50。FoPip4H的定向进化不仅提高了周转率和热稳定性，还抑制了不需要的过度氧化产物，如二聚体和αKG加合物。

αKG OXs的催化多功能性开启了通往复杂氮杂环的有效途径。其中，SaEctD展示了酶促C-H氧化如何简化哌啶合成。最初被鉴定为ectoine 5-羟化酶的SaEctD，随后被发现可催化L-哌可酸(52)的区域和立体选择性C4-羟基化，在优化的αKG负载量下以99%转化率生成反式-4-羟基-L-哌可酸(53)。这种生物催化转化为阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)临床批准药物iptacopan(54)关键手性中间体的规模化获取提供了途径。通过将该酶促C-H氧化与后续的自由基交叉偶联相结合，研究人员建立了一种模块化的酶偶联策略，能够快速构建多样取代的哌啶，为传统的多步骤合成提供了简洁且可持续的替代方案。

类似地，优化的FrbA变体Rd10bb在底物负载量超过70 g/L的条件下介导L-脯氨酸(55)的反式-C3羟基化，从而实现了用于肽类药物enlicitide decanoate(57)和天然神经毒素(+)-石房蛤毒素(58)的羟基脯氨酸构建模块反式-3-羟基-L-脯氨酸(56)的>400 kg规模合成。通过迭代酶工程，FrbA的区域和立体选择性从混合羟基化调整为近乎专属的反式-C3活性，将一个生物合成酶转化为可规模化的合成工具。这突显了蛋白质工程如何将αKG OXs重新定位为可扩展合成的强大且选择性高的生物催化剂。