荧光发射的电化学控制：从强度调制到单分子开关技术，及其在光学显微镜中的应用

《Accounts of Chemical Research》：Electrochemical Control of Fluorescence Emission: From Intensity Modulation to Single Molecule Switching for Applications in Light Microscopy

荧光显微镜通过电化学调控实现多色成像与超分辨结构分析，利用外加电位调节有机染料和荧光蛋白的发光状态，建立差异化的电化学光谱，结合线性混合解离算法实现多色荧光共定位。在STORM成像中，电化学开关替代传统光化学开关，通过电位调控改变硫醇加成物的动态平衡，可精确调节ON/OFF比例以抑制点扩散函数重叠，提升超分辨成像效率。高频振荡电位进一步加速荧光切换，优化短时动态成像质量。

　　

概览

荧光探针在光学显微镜中的应用使其成为生物研究中的重要工具，因为它们具有高分辨率、高对比度和高灵敏度。荧光发射的时空控制技术的进步不断推动着荧光显微镜技术的发展。一个典型的例子是单分子定位显微镜（SMLM），它能够成像远低于衍射极限的微观结构。在SMLM方法中，荧光团可以在发光状态和非发光状态之间切换。在每一帧图像中，只有一小部分荧光团会发光，它们的位置是通过拟合点扩散函数（PSF）来确定的。通过累积这些定位数据，可以生成具有纳米级分辨率的荧光团分布图。这些发展表明，精确控制荧光团的发光时间和位置是荧光显微镜技术进步的关键，而这种控制几乎完全是通过光来实现的。

在这里，我们展示了我们最近利用电化学方法而非传统的光化学方法来控制荧光发射的进展。我们团队的研究始于发现有机染料Alexa 647对外部电化学势敏感。在同时具有电化学氧化还原活性的三重态清除剂Trolox存在下，该荧光团在正电势下变得更亮，在负电势下则变暗。这一发现促使我们将电化学荧光调控技术扩展到多种有机染料和荧光蛋白上。我们发现，在含有氧化还原介质的低氧缓冲液中，所有测试的荧光团都会对施加的电势作出反应。更有趣的是，不同荧光团的反应方式各不相同。我们将这种依赖于电势的荧光曲线称为电化学光谱。利用这些电化学光谱的差异，我们成功地成像了四种具有相似激发和发光特性的荧光团，并通过线性解混技术将它们区分开来。这种策略利用单束激发激光实现了荧光显微镜的多色成像，从而能够同时观察更多的生物结构。

我们还探索了在SMLM超分辨率显微镜（特别是随机光学重建显微镜STORM）中应用电化学方法进行荧光切换的可能性。在STORM中，有机染料会发生光化学切换：在强激发下，大量荧光团会进入三重态；在存在一级巯基化合物的情况下，它们会通过可逆的巯基加成反应进入暗态。荧光团可以通过光解或氧化恢复到发光状态。基于同样的可逆反应机制，我们开发了一种通过施加外部电势来驱动这一过程的电化学切换方法。所施加的电势通过调节表面电化学氧化还原反应中的活性自由基浓度，从而改变染料的稳态平衡，进而调控其发光特性。因此，可以通过电势可重复地控制荧光团的开启和关闭状态以及切换速率。通过改变电势，可以调整开启和关闭状态的比例，使荧光团密度与标记密度相匹配，减少点扩散函数的重叠，从而提高拥挤结构中的成像分辨率。高频振荡电势还能加速荧光团的切换过程，产生快速、均匀的闪烁信号，适用于超分辨率光学波动成像（SOFI），缩短采集时间，并通过高阶累积量提高成像分辨率。