《Journal of Chromatography B》：Monitoring HEK293 cell extracellular vesicle (EV) production via a polyester capillary-channeled polymer (C-CP) fiber column with HIC modality
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本文针对细胞培养中外囊泡产量监控流程复杂、分离方法在速度、纯度与得率间难以平衡的问题，研究者开发了一种基于疏酯毛细管通道聚合物纤维柱的疏水相互作用色谱技术，用于从HEK293悬浮细胞上清中快速、高纯度地分离和定量细胞外囊泡。研究表明，该方法可在15分钟内完成分离，能有效监测培养周期中外囊泡的浓度变化，并通过多种技术验证了分离效果和囊泡完整性，为细胞培养过程优化和规模化外囊泡收集提供了有效的工具。
在生命科学与生物医药领域，细胞外囊泡正成为一颗耀眼的新星。这些由细胞释放的纳米级脂质双层囊泡，如同微型的“细胞信使”，携带着蛋白质、核酸等重要生物分子，在细胞间通讯、疾病诊断与治疗中展现出巨大潜力。其中，人胚胎肾293细胞因其易于转染和高产特性，已成为重组蛋白、病毒载体以及细胞外囊泡生产的“主力军”。然而，要想将细胞外囊泡真正应用于临床或工业化生产，一道关键的技术壁垒横亘在科研人员面前：如何从复杂的细胞培养上清液中，快速、高效且高纯度地分离出这些微小的囊泡？传统的分离方法，如超速离心耗时漫长且易共沉淀杂质，聚合物沉淀法纯度欠佳，而基于免疫亲和的方法则虽然纯度高但得率有限、成本高昂。这些方法往往在速度、纯度、得率和成本之间难以取得平衡，更难以满足对细胞培养过程进行实时、在线监控的需求。因此，开发一种能够兼顾快速、高纯度、高回收率且适用于过程分析的外囊泡分离与定量平台，对于推动外囊泡研究和应用走向工业化至关重要。
本研究发表在《Journal of Chromatography B》上，由William F. Pons、Stephanie Beitle、Raphael Ewonde Ewonde、Sarah W. Harcum和R. Kenneth Marcus共同完成。他们创新性地将疏水相互作用色谱与一种独特的聚酯毛细管通道聚合物纤维柱相结合，旨在建立一种快速监测HEK293悬浮细胞培养过程中外囊泡释放的新方法。研究者们提出，这种方法不仅能实现快速分离，还能提供高纯度的外囊泡样品，用于下游的深入表征。
为开展研究，作者采用了以下几项关键技术方法：首先，使用HEK293F Viral Production Cells 2.0细胞系进行悬浮培养，建立了生物学三重平行的细胞培养体系，并在长达20天的培养周期内定期取样。其次，核心分离技术是基于聚酯毛细管通道聚合物纤维填充的微孔色谱柱，通过疏水相互作用色谱模式进行分离，采用硫酸铵浓度阶梯降低和乙腈浓度增加的流动相进行洗脱。第三，利用在线紫外吸收检测对洗脱的外囊泡进行定量，并采用商业外囊泡标准品建立定量曲线。第四，通过纳米流式细胞术对分离得到的外囊泡进行粒径分析和膜表面标志物（CD81/CD9）及膜完整性的免疫荧光验证。第五，使用透射电子显微镜观察外囊泡的形态和大小。第六，通过Bradford蛋白测定法评估分离过程中蛋白质杂质的去除情况，以确定外囊泡制品的纯度。
3.1. 色谱方法与外囊泡分离指标
3.1.1. 从HEK293上清中HIC分离外囊泡
研究人员对三组平行培养的HEK293细胞上清液进行了分析。结果显示，在细胞培养期间，代表蛋白质和外囊泡的色谱峰面积均随培养时间增加而增大，且六次平行测定的变异系数低于6%，证明了该方法及培养过程具有高度的重现性。
3.1.2. HEK293细胞培养生产率的定量分析
通过商业外囊泡标准品校准，定量分析了整个培养周期中外囊泡的浓度变化。如图3所示，外囊泡颗粒浓度从第4天的约3×1010particles mL?1持续增加，至第16天达到峰值约1.6×1011particles mL?1，之后略有下降。值得注意的是，外囊泡浓度的增长趋势超越了活细胞密度在第8天达到的平台期，导致每个活细胞产生的外囊泡数在培养后期持续上升。
3.2. 外囊泡分离物的表征
3.2.1. 纳米流式细胞术
对分离得到的外囊泡进行纳米流式细胞术分析，使用抗CD81/CD9抗体和亲脂性膜染料进行双重标记。结果显示，约98%的检测颗粒显示膜染料阳性，确认了囊泡的膜结构完整性；同时有8.2%的颗粒同时呈现膜染料和抗体阳性，证实了外囊泡表面存在CD81/CD9标志物。粒径分析表明，分离颗粒的平均尺寸约为92.6 nm，主要分布在50-150 nm范围内，符合小外囊泡的特征。
3.3. 分离外囊泡的透射电子显微镜观察
透射电子显微镜图像清晰显示了许多具有完整双膜结构、尺寸在30-160 nm之间的囊泡，其典型的“杯状”形态进一步证实了所分离颗粒是结构完整的外囊泡。
3.4. HEK293分离组分的Bradford蛋白分析
通过Bradford蛋白测定法评估分离纯度。数据显示，最终外囊泡组分中的蛋白质浓度比原始上清液降低了约135倍。结合外囊泡浓度计算，其纯度约为3.3×109particles μg?1protein，优于文献中报道的超速离心、聚合物沉淀等方法。
研究结论与讨论
本研究成功地建立并验证了一种基于聚酯毛细管通道聚合物纤维柱的疏水相互作用色谱方法，用于快速、重现性好地从HEK293悬浮细胞培养上清中分离和定量外囊泡。整个分离流程可在15分钟内完成，并能在长达20天的培养周期内，稳定监测外囊泡浓度随活细胞密度和细胞活力的动态变化。研究发现，外囊泡的产量在活细胞密度达到平台期后仍继续增长，这为确定最佳收获时间提供了新见解。
该方法的意义是多方面的。首先，它为解决当前外囊泡分离领域在速度、纯度、得率和成本之间的权衡难题提供了一个优秀的方案。其次，该方法与高效液相色谱系统兼容，易于实现自动化，使其非常适合作为细胞培养过程监控的关键质量属性分析工具，为优化工业细胞培养工艺和实现可扩展的外囊泡收集铺平了道路。最后，通过纳米流式细胞术、透射电镜和蛋白纯度分析等多重技术验证，充分证明了该方法不仅能高效分离，还能很好地保持外囊泡的形态完整性和生物标志物特性。该技术的普适性也已在对其他细胞系和生物流体的分离中得到初步证实，展现了其在更广泛的外囊泡研究与生产应用中的潜力。未来，将此微柱方法放大至制备规模，有望实现从过程监控到规模化生产的一体化工作流程。
