《Journal of Colloid and Interface Science》：Study of the interaction between graphene oxide and cholesterol using different artificial membrane models
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为解决纳米材料与生物膜相互作用机制不清、其在生殖医学应用潜力不明的问题，研究人员开展了氧化石墨烯(GO)与胆固醇在不同人工膜模型中相互作用的研究。结合荧光泄漏、核磁共振(NMR)、拉曼光谱等技术，他们发现GO能重塑脂质双层结构，促进胆固醇重排并增加膜通透性，而非完全破坏囊泡。该研究揭示了GO调控膜性能的分子机制，为开发基于GO的新型辅助受精技术材料提供了理论依据。
研究背景：当纳米材料遇见生命之膜
在细胞世界的边界，有一道精密而动态的屏障——细胞膜。它主要由磷脂和胆固醇构成的脂质双层组成，不仅守护着细胞的内部环境，还调控着物质进出、信号传递等生命活动。在纳米医学的浪潮中，石墨烯及其衍生物，特别是亲水性良好的氧化石墨烯(GO)，因其独特的物理化学性质，在生物传感、药物递送等领域展现出巨大潜力。然而，当这些纳米“访客”接近细胞膜时，它们之间会发生怎样的故事？尤其是GO与调控膜流动性和稳定性的关键分子——胆固醇，如何互动？这成为了一个亟待解答的科学谜题。这个问题的答案，不仅关乎纳米材料的安全性，更可能打开一扇新的大门：能否利用GO来精确地“调节”细胞膜的属性，从而干预某些生理或病理过程？例如，在哺乳动物精子获能这一关键生殖步骤中，精子细胞膜会发生复杂的“脂质重构”，包括胆固醇的移除和再分布，以增加膜流动性，为精卵结合做准备。如果GO能够温和而有效地干预这一过程，或许能为辅助生殖技术带来全新的工具。本研究正是为了深入揭示GO与含胆固醇人工膜相互作用的分子机制，为这一设想寻找证据。
为了探索GO与脂质膜的相互作用，研究者们采用了多学科交叉的技术手段。他们构建了由1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和胆固醇组成的人工膜模型，主要包括脂质体和小滴界面双层(DIBs)。研究使用了多种关键技术：荧光泄漏实验（利用5(6)-羧基荧光素(CF)监测膜通透性变化）、核磁共振(1H NMR)光谱（定量分析DOPC与胆固醇的比例变化）、拉曼光谱和荧光光谱（分析脂质链构象、堆积顺序及胆固醇可用性，使用Filipin III特异性探针）、差示扫描量热法(DSC)（研究膜的相变行为）、动态光散射(DLS)和原子力显微镜(AFM)（表征囊泡尺寸、形态及表面电位），以及基于DIB的水渗透性研究，从多个维度系统评估了GO对膜性质的影响。
研究结果
3.1. GO的表征
研究使用的GO悬浮液经紫外-可见光谱、动态光散射(DLS)和原子力显微镜(AFM)表征。结果显示，GO薄片平均尺寸约为631 nm，表面带负电(-25.02 mV)，AFM成像证实其为片层结构，厚度在0.8至1.7 nm之间，表明主要为单层或少数几层GO。
3.2. 脂质体系统的形态表征
3.2.1. 粒径与Zeta电位
DLS分析显示，纯DOPC脂质体平均直径为101.1 nm。加入胆固醇后，脂质体尺寸随胆固醇摩尔比增加而非单调增大。GO处理后，DOPC和DOPC-Chol脂质体的平均直径均有所增加（例如DOPC-Chol从122.0 nm增至158.0 nm），而Zeta电位变化不显著，表明GO与脂质膜发生了相互作用（如吸附或包裹），但未显著改变其表面净电荷。
3.2.2. 脂质体的AFM分析
AFM图像显示，DOPC-Chol脂质体在与GO作用后仍能保持其完整的球形形态，平均直径在80-120 nm之间，与DLS数据基本吻合。这表明GO的相互作用并未导致囊泡的完全破裂，而是可能引起了膜的重塑。2基底处理前(A)和处理后(B)的AFM显微图。">
3.3. CF泄漏实验
通过监测包裹于脂质体内部的CF染料的泄漏，评估GO对膜稳定性的影响。结果显示，GO显著增加了CF的泄漏速率。对于纯DOPC脂质体，GO使其泄漏速率常数(kobs)增加了近5倍；对于含胆固醇(DOPC-Chol, 50:50)的脂质体，GO引起的泄漏速率增加更为显著（kobs比值从0.386升至3.292 × 10-4s-1）。有趣的是，加入去垢剂Triton X-100后仍能引起荧光信号的进一步大幅上升，证明GO并未完全破坏脂质体，而是增加了其通透性。
3.4. 拉曼光谱分析
拉曼光谱用于分析脂质链的构象和堆积有序度。通过分析C-H伸缩振动区的峰强比(如Iνs(CH3)/Iνs(CH2)和Iνs(CH3)/Iνa(CH2))，发现GO处理显著提高了这些比值，表明脂质链的旋转无序度和运动自由度增加，膜流动性增强。这种效应在含10%胆固醇的样品中最为明显。与已知的胆固醇提取剂甲基-β-环糊精(MβCD)相比，GO引起的膜流动性变化更为显著。此外，分析胆固醇特征峰(Iνs(CH3) Chol/Iνs(CH2)比值)发现，MβCD处理降低了该比值（表明胆固醇被提取），而GO处理反而使其升高，提示GO的作用机制并非单纯的胆固醇提取，而是可能同时涉及对磷脂基质的扰动和胆固醇的重分布。νs(CH3)/Iνs(CH2)和Iνs(CH3)/Iνa(CH2)。">
νs(CH3) Chol/Iνs(CH2)。">
3.5. NMR定量分析
1H NMR被用来精确量化GO处理前后脂质体中DOPC和胆固醇的含量。结果表明，GO处理后，所有样品的DOPC浓度均下降，表明GO与磷脂发生了相互作用。对于高胆固醇比例的样品（如DOPC-Chol 80:20和50:50），GO处理导致DOPC/胆固醇摩尔比降低，表现为胆固醇的相对百分比增加。这证实了GO对磷脂的亲和力可能强于对胆固醇，导致磷脂被优先移出或相互作用，从而改变了膜内的脂质组成平衡。
3.6. DSC分析
差示扫描量热法用于研究膜的相变行为。纯DOPC脂质体在约-17.85°C有一个尖锐的相变峰。加入胆固醇后，相变峰变宽，焓变(ΔHm)降低，表明胆固醇扰乱了磷脂的协同相变。GO处理进一步降低了相变焓，并使相变温度(Tm)略微下降。对于DOPC-Chol (80:20)样品，GO使ΔHm从0.0821 J/g大幅降至0.0199 J/g。这些变化与NMR结果一致，表明GO通过减少参与协同相变的磷脂数量并削弱脂质-脂质间的内聚力，降低了膜的相变协同性和热稳定性。
3.7. 通过Filipin III进行胆固醇检测
Filipin III是一种能与游离胆固醇特异性结合的荧光探针。通过分析其荧光激发光谱的I324/I360比值，可以评估膜中胆固醇的可及性。研究发现，GO处理含胆固醇的DOPC-Chol脂质体后，I324/I360比值从0.727显著增加至0.852，表明GO处理增加了胆固醇的可及性或暴露程度。结合凝胶过滤实验，证明GO促进了胆固醇-Filipin复合物的形成，暗示GO可能诱导胆固醇在双层膜中发生重定向或重分布，使其更易被探针接近，而非将其完全提取出来。324/I360比值与胆固醇浓度的关系图。">
3.8. 水渗透性测量
利用小滴界面双层(DIB)模型测量膜的水渗透性。结果显示，GO的加入显著增加了纯DOPC和DOPC-Chol双层的水渗透性。这种效应在含胆固醇的膜中更为明显，进一步证实GO能有效调节膜的传输特性，增加其对小分子（如水）的通透性。
研究结论与意义
这项发表在《Journal of Colloid and Interface Science》上的研究，通过多技术联用的系统分析，清晰地揭示了氧化石墨烯(GO)与含胆固醇人工脂质膜相互作用的复杂图景。研究表明，GO并非简单地破坏或提取膜成分，而是作为一种“膜重塑剂”发挥作用。其主要机制包括：1. 削弱脂质-脂质相互作用：GO与磷脂强烈相互作用，破坏脂质链的紧密堆积，降低相变协同性，从而增加膜流动性和无序性。2. 改变胆固醇分布与可及性：GO处理降低了DOPC/胆固醇的比例（NMR结果），并显著增加了胆固醇的可及性（Filipin III实验），表明其促进了胆固醇在双层中的重排或向外的重新暴露。3. 增加膜通透性而不引起完全破裂：CF泄漏实验和DIB水渗透性实验均证明GO能增加膜对小分子物质的通透性，但AFM和Triton X-100实验证实囊泡结构保持完整。
与传统的胆固醇提取“金标准”试剂甲基-β-环糊精(MβCD)相比，GO的作用更加多元和深刻。MβCD主要通过包合作用直接提取胆固醇，而GO则能同时作用于磷脂和胆固醇，通过其两亲性表面与膜成分发生多重相互作用（如氢键、静电作用），实现对膜性能（流动性、通透性、组成）更为全面的“重塑”。
这项研究的科学意义在于，它从分子层面阐明了GO这一重要纳米材料与生物膜核心组分（磷脂和胆固醇）的相互作用机制，为理解纳米材料-生物界面提供了重要见解。其应用潜力尤其体现在生殖生物学和辅助受精技术领域。精子获能过程的核心正是精子细胞膜发生胆固醇移除和脂质重构，以增加膜流动性，为顶体反应和精卵融合做准备。本研究表明，GO能以非破坏性的方式有效促进类似的重构过程（增加流动性、促进胆固醇重分布），这为开发基于GO的新型纳米材料，用于在体外受精(IVF)等辅助生殖技术中温和、可控地调节精子细胞膜状态，从而提高受精效率，提供了坚实的理论和实验基础。未来的研究可进一步探索GO在不同细胞类型膜上的作用特异性，并评估其在复杂生理环境中的安全性与有效性。
