通过荧光原位杂交技术研究兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）组织中Lily无症状病毒的分布情况
《Journal of Virological Methods》：Distribution of
Lily symptomless virus in tissues of Lanzhou lily (
Lilium davidii var.
unicolor) by fluorescence in situ hybridisation
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兰州百合无症状病毒（LSV）分布研究采用RNA荧光原位杂交技术，发现病毒在根尖、茎和花器官的表皮、皮层及维管束中强表达，而顶端分生组织（0.65-0.8mm×0.2-0.25mm）和小柱细胞无信号，表明这些区域适合作为离体脱毒培养的起始材料，为百合脱毒体系建立提供理论依据。
杨盼盼|徐学飞|边广雅|张文亮|卞光亚|徐雷峰|周国栋|明俊
中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜花卉生物学与遗传改良重点实验室，农业部蔬菜生物育种国家重点实验室，北京，100081，中国
摘要
百合无症状病毒（LSV）是危害Lilium davidii var. unicolor的主要病毒之一，每年给百合种植业造成数十亿元的损失。病毒在植物体内的分布不均，因此在百合中鉴定无病毒组织区域对于通过体外培养获得无病毒资源至关重要。本研究以携带LSV的Lilium davidii var. unicolor作为实验材料。基于LSV的基因组序列设计了RNA荧光探针，并对其分生组织（根尖和茎尖）、成熟组织（叶片、茎段、花梗）以及花器官（子房）进行了RNA原位杂交实验，以观察LSV在不同组织中的分布情况。结果显示，在茎的顶端分生组织（0.65-0.8毫米×0.2-0.25毫米）和髓细胞中未检测到荧光信号；而在根尖、茎和花梗的表皮、皮层及维管束、叶片的表皮、栅栏组织及海绵组织、叶脉维管束、子房和胚珠中则检测到强烈的LSV信号表达。由于茎段中的髓细胞难以再生和分化，因此Lilium davidii var. unicolor的顶端分生组织可以作为通过体外培养获得无病毒资源的起始材料。
引言
兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）是Lilium davidii的一个品种，属于多年生草本作物（平均收获周期为3-6年）（Li等人，2021年）。它是甘肃省最具特色和最著名的特色农产品之一，年产值接近100亿元人民币（Shi等人，2024年）。在生产中，兰州百合主要通过鳞茎切割或小鳞茎进行无性繁殖并大规模栽培（Tang等人，2020年）。这导致病毒在植株中严重积累，从而降低了品种的质量和产量，严重制约了兰州百合产业的发展。
目前，已鉴定出19种较为明确的百合病毒。其中，有三种病毒在中国广泛传播并造成严重危害，分别是百合无症状病毒（LSV）、百合斑驳病毒（LMoV）和黄瓜花叶病毒（CMV）。其中，LSV属于Betaflexiviridae科Carlavirus属的典型代表病毒，是感染兰州百合最常见的病毒。研究表明，在从甘肃省和宁夏回族自治区收集的332份兰州百合样本中，LSV的感染率为98.2%，CMV的感染率为42.5%，并且确认存在LSV与CMV的混合感染现象。有趣的是，99%的CMV感染植株同时伴有LSV感染（Zhang等人，2018年）。尽管LSV没有明显的症状，但它会降低植株的活力和产量。当与其他病毒混合感染时，还会导致坏死斑点、花和叶片畸形、鳞茎产量下降以及巨大的经济损失（Nesi等人，2009年）。病毒性疾病极难控制，目前尚无有效的化学药剂可以根治。因此，百合的无病毒培养已成为解决这一问题的根本方法。鉴定植物中的无病毒组织或细胞是无病毒体外培养的前提条件（Gong等人，2023年）。
荧光原位杂交（FISH）是一种用于检测细胞和组织内核酸（RNA和DNA）的方法。该方法使用与目标序列互补的荧光标记探针，并结合荧光显微镜技术（Rudkin和Stollar，1977年）。FISH已被用于检测多种植物病毒，如番茄金色花叶病毒（Bass等人，2000年）、豇豆花叶病毒（Carette等人，2000年）、番茄黄化曲叶病毒（Ghanim等人，2009年）、黄瓜绿斑花叶病毒（Shargil等人，2015年）以及百合斑驳病毒（Xu等人，2024年）。此前尚未有研究利用FISH方法研究兰州百合中的病毒分布。
在本研究中，我们设计了针对LSV的特异性探针用于RNA原位杂交分析，观察了LSV在兰州百合的分生组织、生殖器官和营养器官中的分布情况，并确定了无病毒区域。这些结果为兰州百合的无病毒体外培养提供了理论基础。
实验材料
实验材料
本研究使用Lilium davidii var. unicolor作为实验材料。秋季选取直径约为3厘米的均匀一致的鳞茎进行冷藏处理。具体步骤为：将鳞茎浸泡在0.1%的 carbendazim溶液中30分钟进行消毒，然后在通风良好的阴凉处晾干。使用尺寸为60厘米×40厘米×22厘米的百合种植框，在每个框的底部铺设2-3厘米厚的培养基，之后再将鳞茎放入其中进行培养。
百合无症状病毒的检测
RT-PCR实验结果显示，所有样本均扩增出了相同片段的特异性条带（图2）。扩增的片段经过纯化后测序，其长度为198 bp。将该片段序列与LSV基因组序列（AJ516059.1）进行比对，发现两者在7657-7854 bp范围内的匹配度高达76.57%-78.54%，序列一致性为98.5%。
兰州百合根尖和茎尖中LSV的分布
为了确定LSV在Lilium davidii var. unicolor分生组织中的分布情况...
讨论
一般认为，植物病毒不会传染给高等植物的茎尖分生组织（SAM）和根尖分生组织（RAM）。因此，通常使用无病毒的分生组织进行植物无病毒培养，例如草莓、马铃薯、Lilium属植物、菊花等（Katoh等人，2004年；Verma等人，2004年；Al-Taleb等人，2011年；Jia和Tang，2012年；Chinestra等人，2015年）。Nesi等人（2009年）通过连续培养获得了无LSV的Lilium资源...
结论
本研究通过原位杂交实验观察到，在Lilium davidii var. unicolor的茎段顶端分生组织（0.65-0.8毫米×0.2-0.25毫米）和髓细胞中未检测到LSV信号表达；而在根尖、茎和花梗的表皮、皮层及维管束、叶片的表皮、栅栏组织及海绵组织、叶脉维管束、子房和胚珠中则检测到强烈的LSV信号表达。由于茎段中的髓细胞难以再生...
作者贡献声明
边广雅：验证、监督。周国栋：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、概念设计。徐雷峰：验证、监督。明俊：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法学研究、资金申请、数据分析。徐学飞：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、软件应用、方法学研究、调查、数据分析、数据管理。杨盼盼：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFD1602206）以及石家庄市与中国农业科学院合作项目的支持（项目编号：242490322A）。
