《Microchemical Journal》：A precision inhibitor screening strategy from complex herbal medicine for hyaluronidase based on carbon quantum dot sensing and targeted capture technology
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高效筛选透明质酸酶抑制剂的综合策略：本研究创新性地将荧光生物传感与固定化酶亲和色谱相结合，通过碳点-金纳米颗粒复合探针实现HAase活性快速检测，并利用分子印迹技术分离纯化活性成分鞣酸（GA）。实验证明GA对HAase的IC50为111.7 μM，并证实其通过抑制HMW-HA降解发挥抗炎作用，分子模拟显示GA与HAase的结合能达-8.7 kcal/mol。该技术体系有效解决了天然产物中生物活性成分筛选效率与特异性不足的难题。
王梅|袁辉|何新民|杨玲玲|杨志刚|高涛|王伟标|马芬|张伟民|吉迪恩·威尔逊·梅宁'奥|萨玉萍|陈晓菲|陈国宁|马学勤
宁夏医科大学药学院，中国银川市沈李街1160号，750001
摘要
透明质酸酶（HAase）是一种负责降解透明质酸（HA）的酶，它通过将抗炎性的高分子量HA切割成促炎性的低分子量形式来破坏HA的结构完整性。因此，开发简单高效的HAase抑制剂筛选策略至关重要。本文建立了一种基于生物传感的目标亲和筛选方法，用于从复杂的草药中鉴定HAase抑制剂。在生物传感系统中，碳点作为荧光探针，而HA功能化的金纳米颗粒作为淬灭剂，加入HAase后荧光强度显著恢复。在优化条件下，HAase在5.3至343.8 U/mL的浓度范围内表现出良好的线性响应。该方法能够快速高效地检测复杂草药提取物中的HAase抑制活性。随后，利用固定化的HAase亲和层析法选择性地捕获、分离并鉴定活性成分。通过阴性对照和阳性对照药物的验证，该筛选模型成功从43种草药中鉴定出Rhodiola rosea L.作为强效的HAase抑制剂。没食子酸（GA）被确定为活性成分，其IC50值为111.7 μM。分子对接和分子动力学模拟结果表明GA与HAase之间具有强烈的结合亲和力。此外，细胞实验证实了GA的抗炎活性，表现为显著抑制LPS诱导的炎症标志物IL-4、IL-5、IL-6和TNF-α。总体而言，本研究建立的集成生物传感和基于亲和力的筛选策略为从复杂天然产物中发现生物活性化合物提供了精确高效的平台。
引言
透明质酸（HA）是一种带负电荷的线性非硫酸化糖胺聚糖，由（β-1,4）-D-葡萄糖醛酸和（β-1,3）-N-乙酰-D-葡萄糖胺重复二糖单元组成[1]。作为细胞外基质（ECM）的关键成分，HA的合成和降解与多种生物过程密切相关，包括受精、胚胎发育、免疫调节、细胞迁移和分化、伤口愈合、炎症和肿瘤生长[2]、[3]、[4]。HA的生物功能很大程度上取决于其分子量，不同大小的HA分子具有不同的作用。高分子量HA（HMW-HA）具有抗炎特性[4]，而低分子量HA（LMW-HA）则促进炎症反应[6]、[7]。透明质酸酶（HAase）是一种降解HA的酶，在整个动物界普遍存在[8]。HAase在多种疾病的进展中起着重要作用。例如，肿瘤细胞中HAase的过表达与癌症进展密切相关，尿液中HAase水平的升高是膀胱癌的潜在生物标志物[9]。此外，HAase通过将抗炎的HMW-HA切割成促炎的LMW-HA，从而刺激促炎细胞因子和趋化因子的产生[11]。HAase抑制剂具有抑制HA片段生成的潜力，被视为有前景的抗炎剂。例如，来自Carissa carandas叶子的熊果酸（UA）可以抑制HAase的活性，并降低人类单核细胞中的炎症标志物水平，如核因子κB[12]。因此，鉴定天然HAase抑制剂对于基础研究和实际应用都至关重要。
草药，包括传统中药（TCM），由于其多样的化学成分和复杂的药理机制，在创新药物开发中受到了越来越多的关注[13]、[14]、[15]。在过去几十年中，从草药中鉴定出了许多具有酶抑制特性的生物活性化合物，包括肽基精氨酸脱亚胺酶4抑制剂[16]、碳酸酐酶IX抑制剂[17]、胰蛋白酶抑制剂[18]和黄嘌呤氧化酶抑制剂[19]。然而，草药的化学复杂性给活性成分的筛选带来了重大挑战。因此，开发简单高效的HAase抑制剂筛选方法至关重要。
目前，有多种方法可用于检测HAase，包括粘度法[20]、比色法[21]、电化学技术[22]和酶谱法[23]。然而，这些方法要么缺乏灵敏度和选择性，要么需要昂贵的抗体和试剂。相比之下，荧光生物传感因其快速性、高灵敏度和便捷性而受到广泛关注。已有几种用于检测HAase活性的荧光传感平台被报道[24]、[25]。在各种荧光探针中，包括贵金属纳米颗粒、有机荧光团和碳点（CDs），碳点作为一种特别有前景的纳米材料类别脱颖而出。这归因于它们的小尺寸、低毒性和优异的生物相容性[26]、[27]、[28]。荧光生物传感方法能够快速筛选复杂系统中的酶抑制剂；然而，在分离单个活性成分方面存在显著挑战。近年来，固定化酶亲和层析法因其优势（如快速分离、低成本、良好的热稳定性和可重复使用性）而受到越来越多的关注[29]、[30]。该技术涉及将目标生物大分子固定在各种载体材料上，如二氧化硅[31]、[32]、磁性纳米颗粒[33]和多壁碳纳米管（MWCNTs）[34]，用于动态筛选。例如，Li等人[35]成功将酪氨酸酶共价固定在磁性MWCNTs上，并利用固定化的酶从Paeonia lactiflora Pall.中捕获酪氨酸酶抑制剂。同样，Meng等人[36]利用亲和层析法有效捕获、分离并鉴定天然产物中的α-葡萄糖苷酶抑制成分，从而证明了该方法在复杂药用植物中筛选抑制剂的有效性。然而，目前关于HAase抑制剂筛选的研究主要集中在优化单个检测方法上[24]、[37]、[38]。荧光传感技术强调高通量筛选，但缺乏分离能力，而亲和层析法可以特异性捕获活性成分，但通量较低。这种高通量方法与分离技术之间的脱节严重阻碍了从复杂天然产物中高效发现HAase抑制剂。
因此，本研究提出了一种集成分析模型，旨在结合生物传感和亲和层析的优势。该模型建立了一种新的分析方法，结合了快速筛选、基于亲和力的捕获和鉴定，从而在复杂样品分析中实现了高通量和高特异性的平衡。通过使用生物传感技术快速缩小候选草药提取物的范围，并利用亲和层析法确保目标化合物的精确捕获，该模型降低了假阳性率并提高了抑制剂筛选的效率。它为快速发现HAase抑制剂提供了一种有效方法。具体而言，该模型包括：(a) 基于碳点和HA-AuNPs静电自组装的新型荧光传感平台。加入HAase后，HA降解为较小的片段，触发碳点的释放并诱导金纳米颗粒聚集，从而实现碳点的荧光恢复。这使得能够快速、高灵敏度地检测HAase活性，并对复杂草药提取物中的HAase抑制剂进行高通量初步筛选。(b) 将这种生物传感平台与固定化的HAase@MWCNTs亲和层析法相结合，创建了一个连续的快速筛选、亲和捕获和目标鉴定过程，克服了单一方法中通量与特异性之间的固有矛盾。(c) 通过分子对接、分子动力学模拟、等温滴定量热法（ITC）和体外抗炎实验对集成模型进行系统验证，以确保鉴定抑制剂的可靠性。本研究为酶活性检测提供了一种精确高效的分析策略，并为复杂系统中药物的快速筛选提供了新的视角。
材料
透明质酸酶（HAase，≥300 IU/mg，来自牛睾丸）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、4-吗啉乙磺酸（MES）和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（上海，中国）。硼氢化钠（NaBH4）、四水合氯金酸（HAuCl4?4H2O，99%）、透明质酸（HA，分子量40–100 kDa）、对氨基酚（PAP）、乙二胺（ETH）和单宁酸（TA）购自Macklin
碳点的表征和荧光优化
TEM图像显示制备的碳点均匀且具有良好的单分散性（图1B）。碳点的尺寸分布显示平均直径为2.8 ± 1.4 nm（图1C）。原子力显微镜（AFM）进一步检查了碳点的形态，确认了它们的均匀分布和球形（图1D）。碳点在415 nm和520 nm的激发波长下表现出高荧光强度（图1E）。此外，一系列激发
结论
总之，成功开发并应用了一种生物传感靶向亲和筛选技术，用于鉴定HAase抑制剂。使用合成的HA-AuNPs@CDs构建了荧光传感平台，能够快速筛选草药中的潜在HAase抑制剂，并实时监测复杂样品。固定化的酶HAase@MWCNTs结合LC-MS成功捕获了作为HAase抑制剂的活性成分GA
CRediT作者贡献声明
王梅：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理、概念化、形式分析、撰写——审阅与编辑、可视化。袁辉：数据管理、概念化、形式分析、可视化、撰写——审阅与编辑。何新民：数据管理、概念化、形式分析、撰写——原始草稿。杨玲玲：数据管理、形式分析、概念化、撰写——审阅与编辑。杨志刚：数据管理、形式分析
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作
致谢
本工作得到了宁夏医科大学重点研究项目（XJKF240324、XJKF240330）、宁夏重点研究与创新计划（2023BEG02014）以及宁夏自然科学基金（2025AAC030477）的开放竞争机制的支持。作者感谢宁夏医科大学医学科技研究中心在实验中的宝贵帮助。
