《Ultrasonics Sonochemistry》：Optimization of deep eutectic solvents-based ultrasonic-assisted three-phase partitioning extraction of polysaccharides from
Pleurotus tuber-regium and its anti-ulcerative colitis activity
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本研究针对传统方法提取菌核侧耳多糖（PTPs）效率低、环境不友好的问题，开发了一种新型DESs（ChCl:1,6-hexanediol）基超声辅助三相萃取（TPP）技术。经BBD优化，该工艺显著提升了PTPs得率（2.61%），并通过DSS诱导的果蝇结肠炎模型首次系统证实了所提多糖PTP-DES2的抗UC活性，为开发PTPs作为功能性食品或药物先导物提供了高效绿色的提取方法和药理学依据。
溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一种慢性、病因复杂的炎症性肠病，患者常伴有血性腹泻、腹痛等痛苦症状，严重影响生活质量。尽管有多种生物制剂和免疫抑制剂用于治疗，但其疗效有限且存在副作用风险。因此，从天然产物中寻找更安全有效的新型治疗策略显得尤为重要。在这一背景下，具有多重生物活性的真菌多糖成为研究热点。菌核侧耳（Pleurotus tuber-regium）作为一种传统食药用真菌，其多糖（PTPs）已被证实具有抗氧化、抗炎和免疫调节等潜力，但针对UC的具体疗效尚未得到系统性验证。此外，PTPs的传统提取方法往往效率低下、耗时长且不够环保。为了同时解决PTPs的潜在治疗价值未被充分挖掘和传统提取方法效率不高的双重挑战，一项发表在《Ultrasonics Sonochemistry》上的研究应运而生，它旨在开发一种高效的绿色提取工艺，并首次在动物模型中验证所提多糖的抗UC效果。
研究人员采用了一种创新的集成技术，主要包括：低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）基超声辅助三相分配（Three-Phase Partitioning, TPP）提取技术。首先，研究人员筛选了不同组成的DESs，发现由氯化胆碱（Choline chloride）与1,6-己二醇（1,6-hexanediol）以1:2摩尔比组成的DES-2提取效率最高。随后，通过单因素实验结合Box-Behnken设计响应面法对提取时间、温度、功率、料液比、硫酸铵质量分数、上下相体积比等多个关键参数进行优化，最终确定了最优工艺。提取得到的多糖组分（PTP-DES2）随后进行了结构表征，包括UV-Vis（紫外可见光谱）、FT-IR（傅里叶变换红外光谱）、HPGPC（高效凝胶渗透色谱）分析其分子量、单糖组成通过PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化结合HPLC（高效液相色谱）分析，并使用SEM（扫描电子显微镜）观察其微观形貌。在活性验证方面，研究采用了葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium, DSS）诱导的果蝇（Drosophila melanogaster）溃疡性结肠炎模型，通过生存率、肠道形态（肠道长度）、肠道通透性（Smurf实验）、肠道干细胞/祖细胞数量（使用esg-Gal4; UAS-GFP/CyO转基因果蝇品系进行荧光标记）以及肠道上皮细胞死亡（7-AAD染色）等多个指标来全面评估PTP-DES2的抗UC活性。
1. DES筛选与提取工艺优化
研究比较了三种DESs以及传统溶剂叔丁醇（t-butanol）的提取效果。结果显示，DES-2（ChCl:1,6-hexanediol）的提取得率最高，为2.47%，显著优于其他DES和t-butanol。单因素实验表明，提取时间、温度、料液比、超声功率、硫酸铵质量分数和上下相体积比对得率均有显著影响，最佳点分别为40分钟、40℃、1:33 mg/mL、320 W、15%和1:2。在此基础上，通过响应面法对料液比、硫酸铵质量分数和上下相体积比三个关键因素进一步优化，最终获得预测得率为2.85%的最优条件。经实际验证，在料液比1:33 mg/mL、硫酸铵15%、上下相体积比1:2的优化条件下，实际得率为2.61%，与模型预测值接近。与传统的热水提取（HWE）、超声水提（UAWE）以及用t-butanol替代DES的TPP系统相比，优化后的DES-TPP方法得率最高（分别为1.99%、2.29%、1.44%），蛋白含量也较低（6.51%），显示出其在提取效率和产物纯度方面的优越性。
2. PTP-DES2的结构表征
结构表征结果显示，PTP-DES2在272 nm处有微弱吸收峰，表明含有少量蛋白质，这与蛋白质含量测定结果一致；FT-IR谱图在~3300 cm?1和~2939 cm?1处显示了多糖典型的O-H和C-H伸缩振动峰。HPGPC分析表明PTP-DES2是一个部分纯化的多糖，分子量分布范围约为9.01 kDa至383.94 kDa。单糖组成分析显示，PTP-DES2由甘露糖（Mannose）、核糖（Ribose）、鼠李糖（Rhamnose）、葡萄糖醛酸（Glucuronic acid）、葡萄糖（Glucose）、半乳糖（Galactose）、木糖（Xylose）、阿拉伯糖（Arabinose）和岩藻糖（Fucose）组成，其中葡萄糖、甘露糖和半乳糖是主要单糖。SEM观察显示，PTP-DES2呈现碎片状、多孔且表面粗糙的不规则形态。
3. PTP-DES2在果蝇UC模型中的抗炎活性
体内活性评估表明，PTP-DES2能显著改善DSS诱导的果蝇UC症状。在果蝇生存实验中，与模型组相比，不同浓度的PTP-DES2处理均提高了果蝇的生存率，其中5%浓度组效果最好。在肠道通透性实验中，DSS处理导致大量果蝇全身被染料染蓝（“Smurf”表型），表明肠道屏障严重受损，而PTP-DES2处理显著降低了Smurf阳性率，说明其有助于维持肠道屏障完整性。在肠道形态方面，DSS处理导致果蝇肠道长度显著缩短，PTP-DES2处理则能有效缓解这种萎缩。进一步研究发现，DSS诱导了肠道干细胞（ISCs）和肠母细胞（EBs）的过度增殖以及肠道上皮细胞（IECs）的大量死亡，而PTP-DES2处理能显著抑制这两种病理变化。
结论与讨论
本研究成功开发并优化了一种基于DES的超声辅助TPP方法，用于高效提取菌核侧耳多糖。优化的工艺在得率和产物纯度上均优于传统方法。更重要的是，研究首次利用DSS诱导的果蝇UC模型，系统地提供了PTP-DES2具有显著抗UC活性的临床前证据。PTP-DES2能够提高模型动物的生存率，改善肠道屏障功能，减轻肠道萎缩，并抑制肠道干细胞的过度增殖和上皮细胞的死亡。这些结果表明，通过该绿色高效工艺提取的PTPs，不仅产量高，而且保留了其生物活性，在肠道炎症模型中表现出明确的保护作用。该研究弥合了PTPs的潜在治疗价值与应用开发之间的关键空白，既为PTPs的高效利用提供了一种先进的提取方法，也为将PTPs开发为炎症性肠病管理的潜在营养品或植物药候选物奠定了药理学基础。这项工作的意义在于，它将绿色化学的先进提取技术与天然产物的药效验证紧密结合，为从食药用真菌中开发新型、安全的抗炎疗法提供了一个可借鉴的研究范式。
