基于细胞的生物混合传感技术，用于检测与入侵性红棕榈象甲相关的挥发性聚集信息素成分

《Biosensors and Bioelectronics》：Cell-based biohybrid sensing of a volatile aggregation pheromone component associated with the invasive red palm weevil

红棕象甲聚集信息素ferrugineol的细胞传感器研究，通过表达RferOR1-Orco受体复合体和GCaMP的HEK293细胞，构建了基于水凝胶微腔阵列的生物传感器，成功实现溶液相0.1-100 μM和气相0.1-100 ppm的检测，解决了传统检测滞后问题。

　　

三村仁敏|大崎敏久|高森翔|穆罕默德·阿里·阿尔萨莱赫|比努·安东尼|武内昌二

神奈川工业科学技术研究所人工细胞膜系统研究组，日本川崎市高津区坂户3-2-1，邮编213-0012

摘要

Rhynchophorus ferrugineus（红棕榈象虫）是一种极具破坏性的入侵性害虫，对全球的棕榈树造成严重农业和经济损失。成年雄虫会释放一种聚集信息素（(4RS,5RS)-4-甲基壬-5-醇，即ferrugineol），这种信息素在棕榈树干内促进虫群形成和侵染。由于这种象虫的整个生命周期都隐藏在树内部，直到造成致命损害才被发现，因此快速、灵敏地检测到其释放的信息素对于早期发现和监测至关重要。然而，目前尚缺乏能够检测这种信息素的实用传感器技术。本文报道了一种基于细胞的生物混合传感器，能够检测气相中的信息素。该传感器使用HEK293细胞，这些细胞同时表达RPW信息素受体RferOR1、其共受体RferOrco以及基因编码的荧光钙指示剂GCaMP。首先验证了这些细胞对水溶液中的ferrugineol（浓度范围0.1–10 μM）的特异性和灵敏度，发现100 μM时响应减弱，表明其响应是非单调的。随后将这些细胞封装在凝胶基质中，并集成到微孔阵列中。结果表明，这种基于细胞的传感器在更宽的浓度范围（0.1–100 μM）内对ferrugineol表现出单调的荧光响应，这可能是由于ferrugineol在凝胶中的扩散受到调节。此外，该传感器还能在亚ppm浓度（0.1–100 ppm）下检测到气相中的ferrugineol。这些发现表明，所开发的传感器为RPW的信息素检测系统提供了技术基础，从而扩展了生物混合传感技术在生态相关气味分子中的应用。

引言

生物混合传感器是将生物识别元件整合到工程设备中的分析平台（Cheema等人，2021年；Deng和Nakamoto，2023年；Hirata等人，2021年；Kuroda等人，2023年；Qin等人，2023年）。这些传感器中使用的生物受体基于目标分析物与受体之间的分子互补性，具有高灵敏度和特异性，类似于钥匙-锁机制。当分析物被识别后，通过先进的光学或电学测量技术将生化反应转化为定量信号。这些生物混合系统在医学诊断、环境监测以及安全和安保应用等多个领域引起了广泛关注（Lim等人，2014年；Marshall等人，2010年；Sankaran等人，2011年）。在各种类型的生物混合传感器中，基于细胞的传感器利用基因工程细胞作为功能传感元件。这些细胞被设计为同时表达昆虫来源的气味受体（ORs）、作为分子识别元件的配体门控阳离子通道，以及作为细胞内信号转导器的钙敏感荧光指示剂（Mitsuno等人，2015年）。基于细胞的传感器的一个关键优势在于其操作简单性和信号稳定性，因为目标诱导的荧光发射完全发生在单个细胞内（图1）。此外，使用成熟的蛋白质表达技术确保了传感器细胞生产的高度可重复性和适应性。

昆虫的功能性受体单元由一个能识别多种气味的OR和一个保守的共受体（Orco）组成，它们共同形成异源复合物，介导信号转导（Wang等人，2024年；Zhao等人，2024年）。ORs与适当配体（气味分子）的相互作用会导致感觉神经元的电激活（Butterwick等人，2018年）。许多ORs的功能已被表征，它们所结合的气味分子也是已知的。OR的选择性从高度特异性（例如信息素受体）到广泛调节不等。昆虫依靠信息素进行多种种内通信（St?kl和Steiger，2017年）。这些化学信号根据其功能进行分类，包括吸引潜在配偶的性信息素、将同种个体吸引到共同位置的聚集信息素、在危险情况下引发逃避或防御行为的警报信息素，以及促进群体凝聚和社会组织的巢穴识别信息素。信息素检测技术的进步不仅加深了我们对昆虫行为和生态相互作用的理解，还对可持续环境管理具有重要意义。应用包括监测和控制农业害虫及入侵物种，以及在其自然栖息地中监测和保护濒危昆虫种群。

亚洲棕榈象虫（通常称为红棕榈象虫，Rhynchophorus ferrugineus）已成为全球最具破坏性的入侵性害虫之一（Oehlschlager，2016年）。在过去三十年中，RPW已入侵近50个国家的棕榈种植园，摧毁了40多种棕榈树，每年造成数亿欧元的经济损失（Hoddle等人，2024年）。在中东、东南亚和欧洲地区，特别是在埃及、沙特阿拉伯、阿联酋、印度尼西亚、马来西亚、意大利、西班牙和法国，都报告了严重的侵染事件。雌性RPW在宿主棕榈的顶端分生组织附近产卵，孵化出的幼虫会在树干内钻洞，造成广泛的内部损伤，这种损伤往往在无法修复之前未被发现（Hoddle等人，2024年）。信息素介导的聚集行为进一步加剧了破坏，它将大量同种个体吸引到同一棵树上，加速了侵染过程，最终导致树木死亡。已确定这种聚集信息素是由两种甲基支链短链烃（(4RS,5RS)-4-甲基壬-5-醇（ferrugineol）和(4RS,5RS)-4-甲基壬-5-酮（ferrugineone）以9:1的比例组成的混合物（Oehlschlager，2016年），这种混合物由位于触角神经元上的气味受体-共受体复合物RferOR1-Orco识别（Antony等人，2021年）。尽管迫切需要能够快速、灵敏且在野外使用的传感器技术来及时干预，但至今尚未实现这样的传感平台。

在这项研究中，我们开发了一种基于细胞的生物混合传感器，用于检测气相中的信息素。通过对RPW化学感应相关基因的研究（Antony等人，2016年）以及随后鉴定出的相关信息素受体（Antony等人，2021年）和共受体（Soffan等人，2016年），为开发这种基于细胞的生物混合传感器奠定了基础。基于我们最近建立的利用凝胶封装的传感器细胞并沉积在微孔阵列中的平台（Mimura等人，2025年），我们构建了传感器细胞，这些细胞同时表达RferOR1-Orco受体复合物（作为识别ferrugineol的主要分子机制）和钙离子敏感的荧光蛋白GCaMP8m。当ferrugineol结合时，RferOR1-Orco复合物作为配体门控阳离子通道发挥作用，导致钙离子流入并随后通过GCaMP产生荧光信号。使用HEK293细胞作为异源表达系统，因为它们能够实现昆虫气味受体复合物和基于钙的荧光测量的稳健功能表达（Butterwick等人，2018年）。我们首先评估了这些传感器细胞对水相中ferrugineol的特异性和灵敏度。随后，将传感器细胞嵌入凝胶基质并集成到带有微孔阵列的微芯片中，以评估它们对水相ferrugineol的响应能力。最后，我们使用开发的传感器芯片检测了气相中的ferrugineol，并评估了其在气相条件下的响应性。

材料

信息素标准品ferrugineol（(4RS,5RS)-4-甲基壬-5-醇）和ferrugineone（(RS)-4-甲基壬-5-酮）由Shin-Etsu Chemical有限公司（日本）提供。用于传感器细胞特异性检测的化学化合物包括乙酸乙酯（Fujifilm Wako Pure Chemical，日本）、异丁酸乙酯、异丁酸甲酯、n-丁酸乙酯和丙酸乙酯（Kanto Chemical，日本），以及VUAA1（Sigma-Aldrich，美国）。这些化合物溶解在二甲

传感器细胞的表征

为了开发一种用于检测红棕榈象虫（RPW）聚集信息素的基于细胞的传感器（图1A），我们设计了能够响应其主要成分ferrugineol的传感器细胞。将编码信息素受体RferOR1、其共受体RferOrco和基因编码的钙指示剂GCaMP的质粒载体短暂转染到HEK293细胞中（图1B）。RferOR1及其共受体RferOrco在质膜上共同形成异源配体门控阳离子通道

讨论

利用昆虫气味受体，我们开发了一种能够检测气相中ferrugineol的生物混合传感器，ferrugineol是红棕榈象虫的聚集信息素。传感器芯片由密集嵌入凝胶基质并排列在微孔阵列中的工程化传感器细胞组成。这些传感器细胞同时表达RferOR1-Orco受体复合物和钙敏感荧光指示剂，从而在识别信息素时产生选择性荧光响应。

结论

本研究开发了一种基于细胞的生物混合气味传感器，能够使用表达气味受体的细胞检测挥发性信息素。该传感器成功检测到了气相中亚ppm级别的红棕榈象虫的生态相关聚集信息素ferrugineol，证明了将表达受体的细胞集成到微孔阵列中的可行性。这种方法为开发能够选择性响应的基于细胞的生物传感器提供了有希望的方向。

CRediT作者贡献声明

大崎敏久：撰写——初稿、监督、方法学、资金获取、概念化。三村仁敏：撰写——初稿、方法学、研究、资金获取、形式分析。穆罕默德·阿里·阿尔萨莱赫：监督、项目管理、资金获取。高森翔：撰写——审稿与编辑、方法学。武内昌二：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念化。比努·安东尼：撰写——初稿

未引用参考文献

Misawa等人，2019年；Takaku等人，2024年。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI，GPT-5.1）来提高手稿的英语语言质量和可读性。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢沙特阿拉伯利雅得的King Saud大学的科学研究部正在进行的研究资助计划（ORF-RC-2025-3808）、CREST（JPMJCR20C4）和JSPS KAKENHI（23K06733）的支持。作者还感谢Shin-Etsu Chemical公司的T. Watanabe先生提供ferrugineol和ferrugineone。同时感谢KISTEC的M. Kiji女士提供的宝贵技术协助。