基于光学检测磁共振技术的细胞内温度测量方法：利用植入粘附性癌细胞中的纳米钻石

《ACS Applied Nano Materials》：Optically Detected Magnetic Resonance Based Intracellular Thermometry Using Nanodiamonds Implanted in Adherent Cancer Cells

　　高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

细胞内温度影响细胞代谢和肿瘤微环境，但关于细胞的基本热性质仍缺乏共识，可靠的测量工具也较为匮乏。我们利用含有荧光氮空位（NV）中心的纳米钻石（NDs）植入胶质母细胞瘤细胞中，通过光学检测磁共振（ODMR）技术测量细胞内温度，并结合双荧光和明场成像技术确定ND与线粒体的距离。通过精心选择ND、改进曲线拟合方法以及时间平均处理，实现了细胞反应的可重复测量。当使用5 μM的FCCP使线粒体解偶联时，我们观察到ODMR信号发生变化，这与约1.7°C的温度升高一致。

**引言**
温度在许多重要的细胞功能中起着关键作用，包括生长、代谢、蛋白质折叠、DNA复制以及整体细胞信号传导。(1) 除了正常的细胞生长和发育外，细胞对温度变化的反应改变还与多种病理状况有关，包括癌症。(2) 鉴于许多恶性肿瘤的高代谢需求、复制不朽性等特征，温度在癌症中的作用尤为值得关注。(3) 在治疗方面，热疗也被用于单独治疗或与其他治疗方法联合使用。(4) 最近，肿瘤温度和全身温度被作为免疫疗法和化疗效果的临床前指标进行监测。(5) 虽然温度在组织水平上的作用已被广泛认可，但在单细胞或细胞内水平上，温度调节和响应机制仍不明确。细胞内最大可能产生的热量以及热梯度仍存在争议。(6) 关于细胞内温度的争论之一是，单个细胞内是否能够产生足够的热量使温度升高1°C。尽管一些研究已经测量到了这种变化，(8,9) 但其他研究认为，根据已知的细胞能量学和热性质，这种变化在物理上是不可行的。(10) 在癌症背景下，这一争论尤为重要，因为肿瘤微环境的异质性非常高。

为了准确研究细胞内温度的作用，使用精确可靠的工具至关重要。虽然近年来细胞内传感器的数量大幅增加，但专门用于温度检测的传感器仍然很少。常用的细胞内温度测量方法包括荧光聚合物、(9) 有机染料、(11) 拉曼光谱、(12) 以及各种荧光纳米颗粒。(13) 在荧光纳米颗粒中，含有负电荷荧光氮空位（NV–）中心的纳米钻石（NDs）具有许多独特优势。(14) NDs化学性质稳定，易于被细胞摄取。(15) 它们对多种生物物理刺激（尤其是温度）具有出色的光稳定性和灵敏度。(16) 多个研究小组已使用NDs对亚细胞成分、(17) 细胞内(18,19) 以及特定癌细胞系(20,21)进行温度测量。然而，关于代谢扰动对细胞内温度影响的ND测量数据有限(22,23)，尤其是针对癌细胞的数据更为缺乏。

在这项工作中，我们开发了一种稳健的分析方案来测量细胞内温度，包括细胞培养基更换、添加溶剂（DMSO）和环境pH值变化等对照实验。然后，我们通过研究U251胶质母细胞瘤细胞内化的NV纳米钻石，探讨了线粒体解偶联剂FCCP对细胞内温度的影响。利用明场和荧光成像技术，我们监测并定位了纳米钻石的位置，并比较了细胞耗氧率的变化与5 μM FCCP处理后细胞温度的变化。

**温度测量技术**
我们的温度测量技术使用了含有NV–中心的定制纳米钻石。NV–中心是一种钻石晶格缺陷，由一个替代氮原子和一个相邻的晶格空位组成，形成一个双电子自旋系统，如图1A所示。NV–中心具有自旋三重态基态，其荧光强度依赖于自旋状态。(24) 在532 nm激光激发下，ms = 0态的循环时间较长，表现出稳定的荧光；而ms = ±1态则强烈向亚稳态单重态跃迁，导致荧光强度降低。ms = 0（亮）态与ms = ±1（暗）态之间的跃迁能量称为零场分裂（Dgs），其频率约为2.87 GHz。Dgs的温度依赖性是基于NV的温控技术的基础。

**图1**
(A) 示意图展示了钻石晶体中的氮空位缺陷（左图）和NV–能级图（右图）。ms = 0和ms = ±1自旋态分别位于基态（底部）和激发态（顶部）。绿色箭头表示激光激发，红色箭头表示荧光发射。激发态和基态ms = ±1之间的较暗红色箭头表示荧光减弱。能量图中黑色箭头指示了对温度最敏感的能量间隙。(B) 左图为光学检测磁共振（ODMR）实验的基本装置示意图，右图为ODMR曲线示例，可通过该曲线确定ms = ±1态的跃迁能量。ODMR曲线经过归一化处理，是136次频率扫描的平均值（使用BioRender.com生成）。(C) 分别为40°C和25°C条件下单个ND的ODMR曲线示例，每条曲线均为ODMR数据的双洛伦兹拟合结果。(D) 通过逐步调节载玻片温度并同时测量ODMR峰位移得到的单个ND校准曲线。

**实施NV-ND基温度测量**
为了实现基于NV-ND的温度测量，我们构建了一台定制的共聚焦显微镜（详见支持信息，图S1）。图1B展示了显微镜的关键组件，该显微镜能够在测量荧光的同时追踪单个细胞内的ND，并用微波能量照射。图1B的插图显示了Dgs附近微波频率下荧光强度的归一化结果；两个荧光强度低谷分别对应ms = +1和ms = ?1态的跃迁。这种自旋态跃迁的光学检测方法称为光学检测磁共振（ODMR）(详见支持信息，图S2)。Dgs的值是ms = +1和ms = ?1态频率的算术平均值，其变化与温度变化相关。

**温度诱导的ODMR曲线变化**
图1C展示了一个实验示例：单个ND被粘附在载玻片上，并分别暴露在25°C（蓝色曲线）和45°C（红色曲线）的水浴中。尽管对比度和线宽也可能发生变化，但ODMR中心频率Dgs的变化与温度变化最为一致。图1D展示了某ND在不同温度下的ODMR位移校准结果（具体制备方法详见支持信息：方法部分）。通过对多个ND进行校准，得到平均灵敏度dDgs/dT = ?91 ± 5 kHz/°C，该值被应用于所有后续测量中。

为了将NV-NDs作为细胞内纳米温度传感器，我们开发了一种将NDs植入U251胶质母细胞瘤细胞的方案，并研究了它们的定位情况。ND浓度和植入过程经过优化，使每个细胞内含有5到10个NDs（详见支持信息：方法部分）。

**ND在细胞内的动态与定位**
为了观察ND在细胞内的动态及其定位情况，我们使用LysoTracker Green和MitoTracker DeepRed对U251细胞进行染色。这种染色方法允许在明场下连续观察细胞形态，并在三个不同的荧光通道中同时观察NDs、溶酶体和线粒体。图2A显示了多个U251细胞及其吞噬的NDs的明场图像；NDs遍布整个细胞，但在某些区域聚集较多。图2B显示了同一明场图像，但叠加了LysoTracker Green荧光通道（显示溶酶体位置）；图2C显示了同一明场图像，叠加了MitoTracker Red荧光通道（显示线粒体密度）；图2D显示了计算出的ND质心（红色点）和溶酶体质心（空心绿色圆圈），两者均叠加在明场和线粒体密度图像上。大多数红色点位于绿色圆圈内（表明被溶酶体吞噬），且靠近线粒体。

**结论**
通过使用ND质心和线粒体密度掩膜图像，我们确定了每个ND与最近线粒体表面之间的距离。图2E显示了图2D中ND质心与最近线粒体边缘的连接情况；图2F显示了18个ND与最近线粒体之间的距离分布。NDs通常位于线粒体附近，而非内部，且大多数ND与最近线粒体表面的距离小于1 μm。虽然图2显示的是粘附细胞中ND被溶酶体吞噬的静态图像，但实际上细胞是动态变化的：细胞沿玻璃表面移动，溶酶体内的NDs会移动，线粒体密度也会发生变化。支持信息中提供了捕捉这些动态变化的视频。

**可靠性验证**
为确保细胞内ND温度传感器的稳健性和可靠性，我们进行了多项对照实验。在实验过程中，在添加FCCP之前，我们向PDMS孔中补充了100 μL加热后的培养基，以确保细胞获得充足的营养并保持环境稳定状态。为了验证培养基添加是否会影响细胞温度，我们在添加培养基前后分别测量了4个细胞内的温度（图3A）。所有温度值均相对于添加培养基前的平均值进行归一化。不同天采集的细胞中的ND用不同标记表示，配对t检验显示培养基补充并未导致细胞内温度显著变化。不同的标记物代表在不同日子测试的不同细胞中的纳米钻石（NDs）。虚线黑色水平线表示四次实验重复的平均温度。(B) 与(A)相同，但不是更换培养基，而是向温度调节的细胞培养室中添加了0.125 μL的DMSO。数据是如(A)中所述的4次实验重复的结果。(C) 比较直接粘附在玻璃载玻片上的NDs在温度调节的细胞培养室中暴露于三种不同pH缓冲液时的温度变化。pH缓冲液通过三次洗涤进行更换。每个标记物都是一个单独的ND，但粘附在同一块玻璃盖玻片上。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

检查DMSO对细胞温度的影响也很重要，因为我们的代谢药物FCCP是溶解在DMSO中的。在向500 μL的培养室中添加0.125 μL的DMSO之前和之后20分钟，跟踪了一个细胞内纳米钻石并测量了其温度。如图3A所示，在图3B中，温度变化用不同的标记物表示，这些标记物代表用于不同实验的NDs。尽管在DMSO处理后的几次温度读数相对于DMSO处理前的基线平均值有所升高或降低，但对4个被研究的NDs进行的配对t检验显示没有显著的温度变化。

许多现象，包括施用各种药物，都可能影响细胞内pH值。(25) 为了评估ND对pH变化的敏感性，我们研究了粘附在玻璃载玻片上的4个ND，并将它们暴露在pH为6、7和8的pH缓冲液中（图3C）。这4个ND的温度在pH 7下连续测量了30分钟，然后在pH 6下测量了30分钟，最后在pH 8下测量了30分钟。图3C显示了温度变化与pH缓冲液的关系，并将其归一化到pH 7时的温度测量值。配对t检验显示，对于升高的和降低的pH值，温度读数没有显著变化。

为了观察一种常被认为与产热有关的代谢药物的影响，(26) 我们向U251细胞施用了5 μM剂量的FCCP。FCCP的作用是破坏线粒体内膜上的质子梯度，从而减少ATP的合成(27)（图4A）。这种ATP生成的减少会促进氧化磷酸化的速率增加和氧气消耗率的上升。

图4
图4. FCCP给药后的代谢活动增加。(A) 线粒体内膜的示意图，显示了三个负责在膜上创建H+梯度的蛋白质复合体以及利用H+梯度合成ATP的ATP合酶。下方面板显示了线粒体解偶联剂FCCP的作用，它使膜变得多孔，导致H+梯度迅速消散，从而减少ATP的合成。(B) 在向20,000个U251细胞群体中添加5 μM FCCP之前和之后，测量了细胞外通量（OCR）。每个点是对12个不同孔中20,000个细胞的OCR的平均值。(C) (B)中的归一化数据显示，添加FCCP后OCR增加了66%（标准差=11%）。黑色框的位置表示群体的中位数，误差条代表一个标准差。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

为了确定最佳的FCCP剂量，我们使用Seahorse仪器测量了一组粘附的U251细胞在施用不同浓度FCCP期间的氧气消耗率（OCR）。图4B显示了响应5 μM FCCP剂量时OCR水平的增加。支持信息图S4显示了其他FCCP浓度下的OCR响应曲线。图4B中的每个点对应大约20,000个细胞的OCR，这些数据是在12个孔中平均得到的。在FCCP给药后20分钟内，可以观察到OCR水平的显著上升。OCR在FCCP给药前后的归一化比较显示OCR增加了66%（标准差=11%）（图4C）。

接下来，我们通过将U251细胞与稀释的ND悬浮液一起培养，然后将细胞培养室安装在我们定制的显微镜中，来测量细胞对FCCP给药的温度响应（支持信息图S1B）。接着使用宽场成像系统对含有ND的细胞进行成像，以识别健康细胞区域，然后使用共聚焦荧光成像来识别适合进行温度测量的单个ND（支持信息表S2列出了ND的选择标准）。然后选择了一个ND并在整个实验过程中对其进行跟踪，并在向充满培养基的培养室中添加10 μL FCCP溶液（最终浓度为5 μM）之前的60-90分钟内测量其温度（图5A显示了该实验的一个温度响应曲线示例）。垂直黑线表示在89分钟时添加了FCCP。虽然温度测量值有显著波动，但在FCCP添加后10-15分钟开始出现了一个明显的温度上升，在接下来的1小时内温度保持升高状态。

图5
图5. 代谢扰动对细胞内温度的影响。(A) 在添加5 μM FCCP之前89分钟和之后66分钟，由单个细胞内ND报告的温度。每个数据点是从150秒内获得的136条ODMR曲线平均值中提取的温度测量值。所有温度值都通过一个共同的归一化常数进行了偏移，以将前10个数据点的平均值设置为38°C。趋势线是通过执行局部加权散点平滑（LOWESS）创建的。(B) 比较(Figure A)中FCCP给药前（23个点）和给药后（22个点）的细胞内温度测量值，并将FCCP给药前的测量平均值归一化为零，以显示温度变化（2.1 ±1.4°C，p = 0.00001）。低p值表明即使测量噪声较大，也能利用密集的时间采样检测到显著的变化。(C) 比较四次实验重复的FCCP给药前后的温度，包括标记为EXPT.1的数据。(B)中的每个标记物代表在不同日子对1个用5 μM FCCP处理的细胞中的1个ND进行的温度测量（1.7 ± 0.6°C，p = 0.01）。(D) 温度（红色）和OCR响应（黑色）的叠加图，显示了FCCP给药的情况。红色点代表来自不同细胞中不同细胞内ND的4次实验的平均值。数据被分成6分钟间隔并取平均值。黑色点代表图4B中的平均OCR。趋势线是通过执行局部加权散点平滑（LOWESS）对相应的颜色编码数据创建的。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

在研究这个示例实验（图5B）中FCCP给药后的温度变化时，我们发现温度上升了2.1 ±1.4°C。此外，当比较4个生物学重复实验时，添加FCCP后细胞内温度读数比之前高1.7 ± 0.6°C（图5C，p = 0.01）。将4个生物学重复实验的平均温度响应与随时间变化的OCR测量值进行比较，可以直接比较FCCP给药的时间动态（图5D）。我们观察到最大温度升高（32 ± 5分钟）和最大OCR升高（32 ± 5分钟）的时间是一致的，这与线粒体解偶联与温度升高相关的观点一致。

我们的结果表明，可以使用基于纳米钻石的温度测量技术来测量细胞内温度变化，但较大的测量变异性需要对这些温度数据进行统计处理。最近的研究表明，复杂的细胞内电场变化可能会影响基于ND的温度测量，而功能化的ND和其他测量技术可以减少这些影响。(22) 在我们的工作中，我们通过仔细的ND表征和选择过程、进行生物对照实验以及获取可以统计分析的更大数据集来克服这些挑战。我们认为我们的方法与最近发表的这项领域的研究相辅相成(22)，同时也注意到了细胞类型和传感器与线粒体接近程度之间的重要差异。关于非热因素对ODMR形状参数影响的额外讨论见支持信息：FCCP和对照实验期间的ODMR形状参数。

利用我们的数据收集和分析技术，我们观察到ODMR中心频率的变化与FCCP引起的细胞内温度升高1.7°C一致，这与之前的研究结果一致。使用ND和其他技术，其他团队报告在COS-7成纤维细胞中温度升高了1.02°C，(9) 在棕色脂肪细胞中升高了1.60°C(28)，以及在C-Elegans线虫中升高了4.0°C(29)。虽然这些实验结果令人信服，但理论建模预测基于假设的细胞内热性质，最大细胞内温度升高不可能超过1e-5°C。(10) 可能是细胞的热性质被严重低估了，也有人提出，高于预期的产热水平和未考虑的热传递使得现有的建模不够准确。(30) 此外，我们目前使用的是癌细胞模型，这种细胞的代谢可能比之前研究的细胞类型更为活跃。最后，除了线粒体产生的热量外，药物诱导的信号传导也可能在其他细胞区室中引发放热反应，从而提高细胞温度。

总之，我们开发了一种使用NV-纳米钻石（NDs）进行细胞内温度测量的方法，并将其应用于U251胶质母细胞瘤细胞温度变化的研究。通过确定从ODMR数据中提取温度信息的协议，并关注结果的一致性和可重复性，我们加强了ODMR变化由热效应引起的论点。利用这种方法，我们观察到FCCP给药后温度变化约为1.7°C，进一步支持了细胞内温度变化可以与生物过程相关联的观点。在未来的工作中，我们计划通过研究其他细胞类型、改进我们的NV-ND传感器以及引入其他代谢扰动来进一步了解代谢与细胞内热力学之间的联系。