COVID-19大流行的爆发推动了mRNA疫苗的突破性进展，这些疫苗具有高表达效率、短开发周期以及通过体外转录（IVT）实现大规模生产的潜力[1]。然而，mRNA疫苗受到严格的储存和运输要求、易降解性和短半衰期的限制。为了解决这些挑战，环状RNA（circRNA）由于其共价闭合的环状结构而表现出显著的优势，包括更高的稳定性、较低的免疫原性和持续的蛋白质翻译效率[[2], [3], [4], [5]]。目前，circRNA已被应用于阿尔茨海默病的治疗、心血管疾病的诊断和治疗以及预防性核酸疫苗[6,7]。它作为mRNA技术的2.0版本，在生物医学领域具有巨大的潜力。
为了推进circRNA治疗的临床转化，需要高效且可控的合成策略。体外RNA环化策略包括化学合成、酶促连接和核酶介导的自剪接。其中，利用置换内含子-外显子（PIE）系统的核酶策略是高效的方法[8]。具体来说，通过体外转录（IVT）合成的线性前体RNA含有反向剪接序列，在Mg2?和高温条件下能够通过自催化作用形成circRNA[8,9]。然而，体外环化（IVC）过程中不完整的反应和环打开过程不可避免地会产生多种RNA杂质，包括未反应的前体、被切除的内含子以及由于circRNA骨架切割产生的断裂RNA[10,11]。值得注意的是，断裂RNA与circRNA具有相同的序列长度和高度相似的二级结构，这使得它们之间的区分特别具有挑战性[9,12,13]。据报道，这些杂质会对circRNA治疗的免疫原性和效果产生不利影响[11,14]。因此，准确表征circRNA的纯度以及将其与结构相似的副产物可靠分离仍然是尚未解决的分析难题。
目前，已经开发出多种用于识别circRNA的方法。Sanger测序和Northern印迹分析通过检测circRNA序列中的反向剪接连接（BSJ）来表征circRNA；然而，BSJ序列也存在于断裂RNA中，这使得它们无法区分circRNA和断裂RNA[3,15,16]。传统的色谱方法如离子交换色谱和尺寸排阻色谱（SEC）由于它们的化学组成和电荷密度几乎相同而无法有效分离[8,17]。基于RNA拓扑结构的分离仅通过离子对RP-HPLC实现，但需要相对较长的分离时间和大量的有机溶剂[18]。
凝胶电泳是另一种常用的分离方法。然而，circRNA在不同电泳系统中的迁移行为存在显著差异。例如，在自铸琼脂糖凝胶中，circRNA严格按照分子长度迁移，但在商业E-Gel系统中则表现出明显的迁移延迟[[19], [20], [21]]。后续研究表明，circRNA的电泳行为对凝胶基质组成、染色染料、电泳时间和批次间变异性非常敏感，导致迁移模式不一致和重现性差[[19], [20], [21], [22], [23]]。尽管如此，其背后的机制仍很大程度上尚未被探索。
基于毛细管凝胶电泳和激光诱导荧光（CGE-LIF）的技术通过结合基于聚合物的分子筛分和荧光检测，提供了高分辨率和灵敏度的核酸分析[24], [25], [26], [27], [28]]。该技术已广泛应用于蛋白质、类病毒颗粒和核酸等生物大分子的定性和定量分析[29], [30], [31], [32], [33], [34]]。然而，当应用于circRNA时，CGE-LIF也表现出条件依赖性的迁移行为。例如，使用Agilent Fragment Analyzer RNA试剂盒无法区分circRNA和断裂RNA[35]，而我们的初步结果表明，使用SCIEX的RNA 9000 Purity & Integrity试剂盒可以有效分离circ-EGFP与其断裂RNA和前体。这些观察结果表明，毛细管凝胶基质的组成可能在调控circRNA迁移中起关键作用，这与平板凝胶电泳中的差异类似。尽管如此，这些差异的机制基础尚未阐明，限制了circRNA分离和表征策略的合理优化。
在这项研究中，我们开发了一种CGE-LIF方法，用于精确分离和鉴定circRNA与其线性前体和断裂物种。该方法应用于不同长度的实际IVC产物（1658-nt EGFP circRNA和2591-nt Fluc circRNA）的纯度评估。通过包括RNase处理、AGE和RP-HPLC分析在内的正交方法确认了RNA的身份。系统评估了CGE-LIF方法的适用性、分离效率和重现性，为建立circRNA药品质量控制标准提供了技术支持。此外，我们系统地研究了影响circRNA在电泳系统中迁移行为的关键因素，为开发稳健可靠的circRNA表征和质量控制分析策略提供了机制上的见解。
