纳米结构脂质载体（NLCs）通过表面点击化学偶联提升M2e多肽免疫原性，优化抗流感通用疫苗策略

《Advanced NanoBiomed Research》：Nanostructured Lipid Carriers Overcome the Low Immunogenicity of M2e Peptide via Surface Click Chemistry Conjugation, Improving the Anti-M2e Antibody Response

这篇原创性研究推荐一种新型流感通用疫苗平台。研究者针对保守但弱免疫原性的M2e多肽，利用生物正交点击化学（SPAAC）将其精确偶联至纳米结构脂质载体（NLCs）表面，并引入通用辅助性T细胞表位（PADRE），在动物模型中成功诱导出强大且特异性聚焦于天然M2e构象的体液与细胞免疫应答。该工作为开发能对抗多种流感病毒株的“通用”疫苗提供了有前景的技术路径。

　　

引言：流感病毒的挑战与M2e的机遇

季节性流感是一个重大的全球健康负担，每年导致多达65万例呼吸道相关死亡。流感病毒以其快速突变能力而臭名昭著，导致抗原漂移和转换，这使得每年都需要根据流行毒株重新配制以血凝素（HA）为靶点的疫苗。虽然当前疫苗能有效保护季节性毒株，但它们无法应对新出现的流感大流行毒株。流感病毒进化的不可预测性凸显了对能够提供广泛、持久保护的“通用”流感疫苗的迫切需求。

在此背景下，流感病毒基质蛋白2胞外域（M2e）多肽成为一个有前景的候选靶点。与HA和神经氨酸酶（NA）等变异较大的抗原不同，M2e在甲型流感亚型中相对保守。然而，M2e本身免疫原性较弱，这可能是由于其尺寸小、在病毒表面丰度低。有限的免疫原性对在常规疫苗配方中激发针对M2e的强大免疫反应提出了挑战。

NLCs：一种有前景的递送平台

脂质纳米颗粒（LNPs）是一种多功能的疫苗递送平台。其中，被称为纳米结构脂质载体（NLCs）的新一代LNPs具有实心核心，并提供优异的稳定性和生物相容性等优势。NLCs可以定制以调节抗原呈递，并能以多聚体形式呈递抗原，从而增强B细胞识别和抗体产生。此外，NLCs可被设计用来共同递送佐剂，如CpG寡脱氧核苷酸，这些佐剂在促进强大的T辅助1（Th1）偏向性免疫反应中起着关键作用，这对于细胞毒性T细胞活化和疫苗诱导免疫的整体有效性至关重要。

研究策略：点击化学、M2e密度优化与免疫增强

本研究的目标是扩展NLC在M2e这类小抗原多肽上的应用。研究采用生物正交的应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）点击化学，将带有叠氮（N₃）基团的M2e肽（M2e-N₃）共价连接到表面修饰有二苯并环辛炔（DBCO）的NLCs上，形成稳定的三唑键。这种策略保留了M2e的关键表位，特别是对构象表位至关重要的半胱氨酸残基Cys-17和Cys-19，并优化了抗原密度和呈递。

首先，研究人员成功制备了NLC-M2e，并证实了M2e表位在NLC-M2e表面的可及性。与游离M2e相比，NLC-M2e接种小鼠后，能将抗体反应更特异性地“聚焦”于表达在细胞表面的天然M2蛋白（cM2），其cM2特异性抗体与抗M2e多肽抗体的比值高出约6.7倍。这表明NLC载体化改善了抗体反应对M2表达细胞的靶向特异性。

在评估NLC表面M2e密度对抗体反应的影响时，研究发现，大约每个NLC上结合40个M2e是激发稳健体液和细胞免疫反应所需的“最低密度”。超过此密度后，增加NLC-M2e的整体剂量（即总M2e剂量）对进一步提升抗体反应的作用，比单纯提高密度更为关键。

接下来，研究团队通过在M2e和叠氮基团之间插入一个由五个氨基酸（GGGGS）组成的柔性接头（Spacer），成功将NLC-spacer-M2e诱导的抗cM2 IgG抗体滴度比NLC-M2e提升了8.2倍。这可能是由于接头减轻了NLC表面和DBCO疏水基团带来的空间位阻，使M2e关键表位能更好地形成和暴露。

PADRE：免疫反应的强力放大器

为了进一步增强免疫反应，研究人员将M2e与一个通用辅助性T细胞表位——泛DR表位（PADRE）融合，合成了M2e-PADRE-spacer-N₃肽，并将其偶联到NLC上。结果表明，NLC-spacer-PADRE-M2e的效果令人瞩目，其诱导的抗cM2 IgG抗体滴度比NLC-spacer-M2e进一步提升了惊人的182倍！同时，PADRE的加入使免疫反应从几乎全是IgG1亚型，转变为更为平衡的IgG1和IgG2a亚型。IgG2a是Th1型反应的重要标志，可更有效地介导调理吞噬和细胞毒性作用。

在细胞免疫方面，所有NLC-M2e配方均诱导了干扰素-γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子-α（TNFα）的产生。流式细胞术分析显示，IFNγ由CD4+和CD8+ T细胞共同产生，而TNFα的产生则局限于CD4+ T细胞。加入Spacer或PADRE并未显著增加细胞因子的产生量，但它们显著增强了辅助B细胞产生抗体的能力。

讨论与展望

本研究证明了NLC作为递送平台，用于增强M2e这类弱免疫原性抗原免疫反应的潜力。通过SPAAC点击化学实现的精确、高效偶联，保留了M2e的关键保护性表位。M2e在NLC表面的载体化不仅增强了其免疫原性，更重要的是将抗体反应“聚焦”于感染细胞表面表达的天然M2蛋白构象，这对于通过抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）等机制实现保护至关重要。

研究的亮点在于系统地评估和优化了多个关键参数。首先，确定了约40 M2e/NLC的“最优起始密度”。其次，通过引入柔性接头有效提升了抗原的暴露和B细胞识别。最为关键的是，通过融合通用辅助T细胞表位PADRE，实现了抗体反应的指数级放大，并诱发了有利于病毒清除的Th1型偏倚的免疫反应，其特征是高水平的IFNγ和IgG2a抗体。使用NLC-spacer-PADRE-M2e免疫的所有小鼠，其诱导的IgG2a滴度均超过了文献中报道的与保护相关的阈值。

结论

总而言之，该研究展示了一种基于NLC和点击化学的模块化、合成型疫苗平台，用于递送M2e抗原。通过优化抗原密度、引入柔性接头和融合PADRE辅助T细胞表位，成功克服了M2e固有的低免疫原性，在小鼠体内诱导出强大、聚焦且具有保护潜力的体液和细胞免疫应答。这些发现为开发能够提供广泛交叉保护的通用流感疫苗候选物奠定了坚实的基础，并为针对其他免疫原性较弱的抗原设计疫苗提供了可借鉴的策略。未来的研究方向包括在动物模型中进行流感病毒攻毒试验以验证其保护效力，并探索该平台在更广泛疫苗应用中的潜力。