《Advanced NanoBiomed Research》：Correlations Between Osteocyte Lacuno-Canalicular Network and Material Characteristics in Healthy and Mechanically Stimulated Murine Tibiae
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本研究利用先进成像技术，揭示了小鼠胫骨中骨细胞陷窝-小管网络 (LCN) 的组织结构、钙含量 (Ca2+) 与纳米级矿物粒子特性 (如T、L、W参数) 之间的强关联。文章核心发现：骨矿物纳米结构主要受LCN组织方式调控，而非单纯钙含量；机械载荷 (loading) 促进的新骨形成虽局部钙含量较低，却具备成熟的晶体结构，提示系统性钙供应主导适应性重塑过程的矿化。
1 引言
骨骼作为具备层次结构、能够抵抗骨折并适应外部机械刺激的生物材料，其纳米尺度特征尤为关键。在该尺度下，羟基磷灰石 (hydroxyapatite) 晶体板嵌入胶原基质，且晶体主要沿胶原纤维方向排列。骨细胞陷窝-小管网络 (Lacuno-Canalicular Network, LCN) 是一个由容纳骨细胞胞体的微米级陷窝和约300纳米宽、容纳细胞突起并促进细胞间通讯的小管构成的相互连接的多孔系统，被认为是骨组织中一个关键的结构特征，在矿物稳态中可能发挥重要作用。然而，骨骼的组成具有空间异质性，尤其是在钙 (Ca) 含量方面存在区域差异，且其作为动态材料，会响应机械需求而进行结构重塑。
本研究旨在定量表征小鼠胫骨中纳米结构与三个关键因素之间的关系：(i) 机械载荷，(ii) LCN的局部有序程度，以及 (iii) 局部钙含量。为此，采用了定量背散射电子成像 (qBEI) 来空间映射钙浓度，共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 来可视化LCN的3D组织，以及小角和广角X射线散射 (SAXS/WAXS) 来揭示包括粒子厚度和取向在内的矿物特性。
2 结果
2.1 加载与非加载骨中钙含量的差异
对五只26周龄雌性C57BL/6J小鼠的左胫骨进行为期2周的非侵入性轴向压缩加载，右肢作为内部对照。CLSM结果显示，仅靠近骨表面处，加载与非加载骨的LCN组织有明显差异。加载骨显示出具有强烈、弥散荧光信号的宽边（），与非加载骨相对光滑的薄边形成对比。这表明宽边代表了响应加载形成的、矿化程度较低的新骨，其过度染色阻碍了这些区域LCN的进一步表征。
当将新形成骨排除在分析之外时，加载与非加载肢体之间的骨矿化密度分布 (BMDD) 未显示显著差异。包含新形成骨则会在分布左侧（低钙含量处）出现一个宽大的肩峰（）。个体内钙含量的变异性低于个体间变异性，表明小鼠个体的骨钙含量主要受系统因素影响。因此，后续评估不再区分加载与非加载骨。
2.2 钙含量与LCN组织之间的相关性
qBEI测量显示小鼠皮质骨中存在钙含量差异的连续区域（）。另一种分类方式基于LCN的组织性：致密且高度有序的LCN常见于板层骨，而无序网络则与编织骨相关（）。这两种分类模式相似（）。
将两者结合，可将骨横截面分为四个不同区域：高钙/无序LCN，高钙/有序LCN，低钙/有序LCN，低钙/无序LCN。统计分析显示，LCN有序区域的平均钙含量显著高于无序区域，且有序区域的LCN网络密度（Can.Dn）也显著更高。钙含量与LCN组织之间的强相关性也导致了高、低钙区域在网络密度上的显著性差异（）。
2.3 矿物粒子特征及其与LCN有序性和钙含量的相关性
同步辐射高分辨SAXS/WAXS用于量化皮质骨中矿物粒子的纳米结构特征。T参数（矿物粒子厚度）分布图显示皮质内部存在一条低T参数带（T参数分布图，(a) 全图，(b,c) 基于LCN有序/无序区域的图，(d,e) 基于高/低钙区域的图。">）。定量评估表明，无序区域的平均T参数（2.56 ± 0.09 nm）显著低于有序区域（2.66 ± 0.08 nm）。L参数（晶体长度）在有序区域也略高，但未达显著水平。
校正了钙含量空间变化的W参数，在高钙区域显著高于低钙区域，且在有序网络区域也显著高于无序区域。矿物厚度 (W参数) 与长度 (L参数) 的长径比分析显示，高钙与低钙区域的长径比差异大于无序与有序区域的差异（）。
2.4 组织学
组织学分析（吉姆萨和戈尔登染色）进一步证实了新骨在骨内膜和骨外膜表面的形成。吉姆萨染色显示了分隔中央骨区域与外围区域的明显粘合线，戈尔登染色则显示外围骨区域存在红色斑块，与qBEI结果一致，确认了新形成骨的矿化程度较低（）。
2.5 不同成像技术的空间关联性
详细的图像比较揭示了不同尺度特性之间的关联。在无序LCN区域，可观察到具有高钙含量的软骨岛，其中矿物粒子（T, W, L参数）往往更大，且无罗丹明染色。在新形成骨边缘观察到T参数的梯度变化，而吸收区域边缘则模糊、参差不齐。此外，在侧向区域观察到高T参数的双线，这些线在qBEI图像中伴随钙含量的变化，且该区域以有序网络为特征。在老骨与新形成骨的界面处，T参数值降低，电子显微镜和吉姆萨染色图像也证实了这一类似粘合线的特征存在（T参数的比较，展示软骨岛、吸收区、新老骨界面及侧向双线等特征。">）。
3 讨论
3.1 骨类型与分化
无序与有序网络的区分有助于洞察初级骨与次级板层骨的结构差异。无序区域主要位于皮质中央，被认为是早期快速生长的骨形成残留物，其小管密度低于具有良好排列网络的有序区域。高钙含量的软骨岛可能来自早期骨形成阶段的钙化软骨。
3.2 不同区域的矿物粒子特性
无序区域的矿物粒子在厚度和长度上都小于有序区域。矿物尺寸随钙含量和LCN组织程度的变化与先前研究一致，表明其对组织年龄有强烈依赖性。机械载荷导致的适应性新骨形成，虽然钙含量显著较低，但矿物粒子的T和L参数值与有序区域相似，表明新骨的矿化很可能主要通过系统性钙沉积而非局部再分布实现。此外，控制性载荷不会损害骨质量，可能降低骨折风险。
在老骨与新骨之间观察到的由低T和W参数值区分的界线，类似于骨重塑部位的逆转线，是不同时间点形成的骨段之间的边界。侧向区域观察到的高T参数双线可能与局部机械应变模式及密集LCN导致的流体流动增加有关，后者可能通过骨细胞及其突起诱导矿物稳态，从而增强成骨活动和矿物粒子的生长。
4 局限性
本研究侧重于对五只小鼠胫骨的详细研究。由于小鼠皮质骨的异质性及同步辐射测量时间有限，选择在较少动物上测量较大区域。样品制备存在挑战，尤其是获取用于SAXS/WAXS测量的完整超薄切片，因此只有包含超过一半皮质的样品被纳入评估。此外，一些样品在CLSM中显示出（微）裂纹，可能是由样品制备引起，这些样品被排除在评估之外。
5 结论
矿物纳米结构与骨细胞陷窝-小管网络 (LCN) 的组织结构关系比与整体钙含量的关系更为密切，且LCN的结构组织与钙含量之间存在稳健的关联。本研究强调了在解释小鼠骨骼实验数据时考虑结构异质性的重要性。机械刺激促进了具有成熟矿物晶体组织但钙含量较低的新骨形成，表明在适应性重塑过程中，是系统性钙供应而非局部矿物再分布驱动了矿化。这一认识从根本上推进了对骨骼层次化适应的理解，揭示了细胞网络与力学环境之间的相互作用如何在纳米尺度调控骨质量。这些结果为未来研究利用骨骼内在重塑机制来改善骨骼健康的有针对性治疗策略奠定了关键基础。
