《Journal of Controlled Release》：Anti-CLEC7A nanobody in situ engineering promotes amyloid-β oligomers clearance by CAR-microglia to alleviate Alzheimer's disease pathology in mice
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本研究通过鼻腔递送靶向小胶质细胞的脂质纳米颗粒（LNP），在脑内生成表达AβO特异性CAR和agonistic anti-CLEC7A纳米抗体的工程化CAR-M。实验表明，该纳米抗体通过激活CLEC7A-SYK信号通路显著增强AβO降解能力，有效降低APP/PS1小鼠模型中的脑Aβ水平，抑制神经炎症并恢复认知功能，为AD治疗提供了新策略。
严崇正|孔志超|潘玉雪|傅志鹏|韩坤|赵晓天|张静|薄龙宇|孙伟毅|高金鑫|董向辉|郑祖林|岳晓|孙鹏|姜新义|陈晨
山东中医药大学药学院，中国山东省济南市 250355
摘要 嵌合抗原受体小胶质细胞（CAR-M）介导的β-淀粉样蛋白寡聚体（AβO）吞噬在阿尔茨海默病（AD）治疗中显示出巨大潜力，然而，CAR-M对AβO的降解能力有限，这影响了其抗AβO的效果。本研究报道了一种原位工程化的激动型抗C型凝集素结构域（CLEC7A）纳米体，以加速CAR-M对AβO的降解，从而增强其抗AβO的效果。具体而言，通过鼻内递送的小胶质细胞靶向脂质纳米颗粒（LNP），将编码AβO特异性CAR和抗CLEC7A纳米体的双mRNA引入脑部小胶质细胞中，生成了具有增强降解能力的CAR-M。实验数据显示，这些工程化的CAR-M表现出更强的吞噬功能，并通过激活CLEC7A-脾酪氨酸激酶（SYK）信号通路来促进细胞内AβO的降解。在APP/PS1阿尔茨海默病小鼠模型中，这些原位重编程的CAR-M显著降低了脑内Aβ水平，抑制了神经炎症，并恢复了认知功能。总之，这些发现表明，增强CAR-M对AβO的降解能力可以有效缓解AD的病理机制，为AD的治疗提供了有前景的策略，同时也可能应用于其他神经退行性疾病。
引言 阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，会导致进行性的认知衰退，影响患者的独立性和生活质量[1]。由于Aβ的产生与清除之间的不平衡，脑内β-淀粉样蛋白（Aβ）的积累是AD发病的关键因素[2],[3]。Aβ肽由淀粉样前体蛋白（APP）生成，会异常聚集形成寡聚体、纤维和斑块[4]。Aβ寡聚体（AβO）是最具神经毒性的Aβ形式，能够引发包括神经炎症、突触丧失、神经元功能障碍、认知障碍乃至痴呆在内的病理过程[5],[6]。靶向清除AβO对于缓解AD的病理至关重要，但目前有效的策略仍然缺乏。
小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的常驻巨噬细胞，在清除神经毒性物质、维持突触可塑性和执行免疫功能方面起着关键作用[7]。在AD的发展过程中，小胶质细胞的吞噬活性——表现为对Aβ聚集物的吞噬和清除——具有重要的神经保护作用[8]。此外，将靶向Aβ的嵌合抗原受体（CAR）引入巨噬细胞/小胶质细胞中，已被证明可以显著增强它们结合和吞噬Aβ的能力，从而在体内有效降低Aβ水平。鉴于小胶质细胞的独特效应功能及其在脑内的富集特性，我们假设通过基因工程改造脑内小胶质细胞使其表达AβO特异性CAR，可以重新定向其吞噬活性，提高AβO定向治疗的效果[9],[10]。NUsc1是一种单链可变片段抗体（scFv），能够特异性地靶向AβO而不是Aβ单体或纤维[11]。这种选择性使得NUsc1成为CAR技术的理想胞外识别域，有助于小胶质细胞选择性地识别和吞噬AβO，从而增强AβO的清除效果，并进而抑制AD的病理进展。
长期暴露于Aβ聚集物和炎症环境会降低小胶质细胞的Aβ降解能力，因此需要增强其功能以优化AβO特异性CAR-microglia（CAR-M）疗法[12],[13]。脾酪氨酸激酶（SYK）是小胶质细胞激活和Aβ降解的关键调节因子，它直接作用于表面受体CLEC7A。用激动型抗体靶向CLEC7A可以激活SYK通路，增强小胶质细胞的Aβ吞噬和降解能力，最终降低体内的Aβ负担[14]。纳米体是一类单域抗体，具有与传统抗体相当的靶标结合亲和力，同时具有体积小、稳定性高和在细胞环境中表达高效等优点[15]。这些特性使它们成为治疗性编辑应用的理想候选者。我们提出，在CAR-M中原位分泌激动型抗CLEC7A纳米体是一种可行的方法，可以协同促进AβO的清除并提高AD治疗的效果。
鼻内给药（IN）是一种非侵入性策略，可以绕过血脑屏障（BBB），将治疗剂高效递送到大脑，但其效果受到鼻腔表面积和鼻黏膜特性的限制[16]。为了优化IN疗法的效果，我们开发了一种高效的脂质纳米颗粒（LNP）递送平台，该平台经过细胞穿透肽（CPP）的功能化处理，以提高鼻上皮的通透性，并使用小胶质细胞靶向MG1肽实现精确递送[17],[18]。我们自主定制的LNP能够将编码AβO靶向CAR和抗CLEC7A纳米体的双mRNA有效引入小胶质细胞，生成具有增强降解能力的AβO特异性CAR-M（图1A）。通过在小胶质细胞和APP/PS1阿尔茨海默病小鼠模型中的全面实验，我们证明了抗CLEC7A纳米体武装的CAR-M能够有效增强AβO的清除作用，并改善AD的进展。总体而言，我们的研究强调了清除能力增强的CAR-M在AD治疗中的潜力。
部分摘录 抗CLEC7A纳米体激活小胶质细胞中的CLEC7A-SYK信号通路 最近的研究表明，激动型抗CLEC7A抗体可以激活CLEC7A，导致SYK（pSYK）和S6K（pS6K）的磷酸化，进而增强小胶质细胞CD11c的表达，从而促进小胶质细胞介导的Aβ降解[14]。值得注意的是，在APP/PS1阿尔茨海默病小鼠模型中，小胶质细胞中的CLEC7A表达显著上调（通过小胶质细胞标记蛋白Iba1进行标记），这表明它可能成为AD的治疗靶点
讨论 阿尔茨海默病是老年人中最常见的神经退行性疾病，会导致进行性的认知衰退，给患者带来严重的生理痛苦和经济负担。越来越多的证据表明，AβO可以引发神经退行性病变，导致突触功能障碍、神经炎症、神经毒性，最终发展为痴呆。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻巨噬细胞，在清除神经毒性物质和维持突触功能方面起着关键作用
材料与方法 试剂和材料 ：用于合成EI-1的试剂包括叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑、N,N-二甲甲酰胺（DMF）、三羟甲基氨基甲烷、4-甲基-1-哌嗪丁酸、三乙胺、1-乙基-3-(3′-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、1-羟基苯并三唑（HOBT）、二氯甲烷（DCM）、甲醇、1-丁胺（TBAF·3H2O），均由上海Bidepharm公司和Meryer（上海）生化科技有限公司提供
CRediT作者贡献声明 严崇正： 撰写初稿、数据可视化、验证、软件使用、资源准备、方法设计、实验实施、概念构思。孔志超： 撰写初稿、数据可视化、验证、软件使用、资源管理、方法设计、实验实施、数据分析。潘玉雪： 方法设计、验证、撰写与编辑。傅志鹏： 撰写初稿、验证、方法设计。韩坤： 软件操作、方法设计。赵晓天： 软件操作、方法设计。张静：
致谢 我们感谢山东大学高级医学研究所/高级医学研究所转化医学核心设施的X.S.、X.Z.、M.W.、H.Y.、W.Z.、Y.Z.和L.W.在技术上的支持。同时，我们也感谢山东大学药学院药学生物学共享平台的X.W.和X.Z.在技术上的协助。此外，感谢Shiyanjia实验室（网址：
www.shiyanjia.com ）在LNP的冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）表征方面的帮助。最后，我们
