《Journal of Controlled Release》：A multidomain peptide-liposome composite for controlled release of a cyclic dinucleotide in oral cancer
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本研究开发了一种肽凝胶-脂体复合系统K2-Lip(CDN)，通过高负载比（8:1）实现环二核苷酸（CDN）的持续释放，显著延长小鼠口服癌ROC1模型的生存期，单次注射效果等同六次单独注射。该材料通过电荷匹配和自修复特性克服传统递送系统的局限性，为局部长效肿瘤免疫治疗提供新策略。
约瑟夫·W·R·斯韦恩（Joseph W.R. Swain）| 安德烈亚·H·莫利纳（Andrea H. Molina）| 杰玛琳·M·松加（Gemalene M. Sunga）| 丹妮尔·丘-马丁内斯（Danielle Chew-Martinez）| 尼拉贾·达尔马拉吉（Neeraja Dharmaraj）| 亚历杭德拉·科博斯·佩雷斯（Alejandra Cobos Perez）| 阿尔加迪普·德伊（Arghadip Dey）| 以法莲·J·巴斯克斯-罗萨多（Ephraim J. Vazquez-Rosado）| 西蒙·杨（Simon Young）| 杰弗里·D·哈特格林克（Jeffrey D. Hartgerink）
美国莱斯大学化学系，6100 Main Street，休斯顿，德克萨斯州77098
摘要 尽管免疫疗法是治疗癌症的一种有前景的策略，但大多数接受单一免疫疗法治疗的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者并未产生反应。因此，研究人员正在研究结合免疫刺激分子的联合治疗方法，以最大化抗肿瘤效果。环状二核苷酸（CDNs）作为STING激动剂，在联合治疗中显示出潜力，但在HNSCC的临床前模型和临床试验中需要频繁进行肿瘤内给药。为了减少给药频率，我们开发了一种肽水凝胶-脂质体复合系统K2-Lip(CDN)，以实现CDN的局部和持续释放。我们研究了阳离子脂质体在阴离子（E2）和阳离子（K2）肽水凝胶中的负载限度，发现E2在所需的脂质:肽摩尔比下会导致聚集，因此我们在复合系统中使用了K2。在8:1的脂质:肽摩尔比下，K2-Lip(CDN)形成了自愈复合水凝胶，并在体外实现了CDN的持续释放，在体内实现了吲哚菁绿（ICG）的持续释放。这种复合材料在体外对ROC1口腔癌细胞表现出细胞毒性，并且在携带ROC1肿瘤的小鼠模型中比单次CDN注射显著延长了生存期。仅使用单剂量的K2-Lip(CDN)所获得的总体生存期与六次重复给药的效果相当。肽-脂质体复合系统所展示的材料特性和持续释放能力可以应用于需要延迟释放局部治疗剂的广泛治疗场景。
引言 针对世界上最普遍的疾病之一——癌症，需要新一代的药物输送系统。癌症被定义为细胞的无序生长，以其逃避标准治疗方法而闻名。传统的多模式疗法（如口腔鳞状细胞癌，最常见的头颈部鳞状细胞癌HNSCC [1]）具有显著的毒性副作用，常常无法根除癌症。多模式疗法包括手术以及辅助的化疗和放疗。化疗和放疗结合使用，虽然能杀死癌细胞，但也会损害健康组织。这种传统的治疗方法导致HNSCC患者的高局部和远处复发率 [2] [3]。不幸的是，非人乳头瘤病毒（非HPV）相关HNSCC患者的预后比HPV阳性HNSCC患者更差 [4]。因此，人们非常希望利用能够将治疗剂局部化的策略来防止全身毒性，并诱导强烈的、持久的抗肿瘤免疫反应，从而减少非HPV模型的癌症复发。
免疫疗法是一种有前景的治疗方式，可以增强免疫系统靶向和杀死癌细胞的能力。然而，目前FDA批准的免疫疗法需要频繁给药，并且是全身给药，这可能导致毒性和严重的不良事件 [5] [6]。FDA批准的用于复发性或转移性头颈部癌症的免疫疗法是免疫检查点抑制剂（ICIs），特别是抗程序性死亡蛋白-1（anti-PD-1）。另一种ICI是抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（anti-CTLA-4），它改变了晚期黑色素瘤的治疗进程 [7] [8]。尽管CTLA-4抑制剂在联合治疗中耐受性良好 [9]，但尚未获得FDA批准。尽管免疫检查点抑制剂解除了淋巴细胞活性的“刹车”，但由于肿瘤微环境的免疫抑制作用，大多数接受单一免疫疗法治疗的HNSCC患者仍无反应 [10]。因此，将免疫检查点抑制剂与局部免疫刺激剂结合使用可以最大化抗肿瘤效果。
环状二核苷酸（CDNs）是一类免疫刺激剂，在2011年发现STING（干扰素基因刺激剂）作为CDNs的免疫传感器后引起了广泛关注 [11]，以及2013年对相关通路激活机制的深入理解 [12] [13]。这些环化核碱基激活了环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-STING通路，这是一种识别细胞质DNA的促炎通路。然而，与其他免疫治疗剂一样，通常需要频繁给药。例如，STING激动剂环状二核苷酸dithio-(RP,RP)-[cyclic[A(2′,5′)pA(3′,5′)p]]（临床上也称为ML RR-S2 CDA，此后简称为“CDN”）在一项I期临床试验中，实体瘤患者每周接受肿瘤内注射 [a>
NCT02675439 。注射CDN后，94%的可评估病变大小稳定或缩小，表明在肿瘤微环境中持续释放CDN可以导致肿瘤消退 [14]。通过设计用于控制药物释放的局部递送平台，可能实现CDN的延长生物利用度，同时减少多次注射，从而提高免疫调节剂的效果并限制全身副作用。
自组装生物材料在实现持续、局部药物递送方面显示出潜力。这些生物材料通过静电相互作用、疏水堆积和氢键等弱分子间力在生理相关条件下组装，提供保护并延迟释放所装载的药物 [15] [16] [17] [18]。此前，我们的团队使用了一种阳离子、自组装的赖氨酸基多域肽（MDP）水凝胶 [19] [20] [21] [22]（此处称为“K2 ”），以实现阴离子CDN的持续释放。这种装载了CDN的水凝胶STINGel在体内口腔癌模型中比装载CDN的胶原水凝胶显著延长了生存期 [23]。这些结果展示了通过控制药物释放可以提高治疗效果。其他提高类似CDNs效果的方法包括将过渡金属-CDN复合物装载到二氧化硅纳米颗粒中 [24]，或将CDN封装在阳离子脂质体中 [25] [26] [27]。尽管这些研究在提高CDNs的生物利用度方面取得了进展，但仍需进一步改进以增强治疗效果。
肽水凝胶由于网孔尺寸大于小分子尺寸，导致小分子快速释放；而脂质体药物制剂由于全身注射后快速清除，无法在目标部位实现高积累 [28]。其他研究者 [29] 和我们 [30] 的先前研究尝试通过创建肽水凝胶-脂质体复合系统来克服这些缺点。为此，我们的实验室将MDP与脂质体结合使用。所得到的复合系统通过改变肽和脂质的组成，实现了可调的荧光团释放动力学 [30]。受到这些结果的启发，我们好奇是否可以使用类似的方法来创建一种用于局部、延迟释放的CDN装载复合材料（见图1）。由于这些复合材料中所需的脂质体浓度较高，我们研究了脂质体浓度对材料特性的影响。研究发现，在脂质体和肽的电荷匹配时，即使在高脂质:肽摩尔比（高达8:1）下仍可以形成自愈水凝胶。然后我们证明了这些装载CDN的复合材料在体外实现了CDN的持续释放，在体内实现了ICG的持续释放，并在体外对ROC1口腔癌细胞表现出细胞毒性。最后，我们发现单次肿瘤内注射这种复合材料的生存期与六次单独注射CDN的效果相当。这项研究突显了MDP水凝胶能够容纳高浓度脂质体药物以实现药物延迟释放的能力，以及复合生物材料在癌症治疗中减少给药频率的潜力。
部分摘要 肽合成 K2 （初级序列：(K2 (SL)6 K2 )（图S1a-c）和E2 （初级序列：E2 (SL)6 E2 ）（图S1d-f）是使用我们实验室之前报道的Fmoc保护策略通过手动固相肽合成方法合成的 [30]。该合成得到了N端乙酰化和C端酰胺化的产物。使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认了肽的分子量（Bruker Instruments，Billerica，MA）（见图）。
K2 -Lip系统的材料特性 我们假设MDP-脂质体复合材料（MDP-Lip）中CDN的延迟释放可以增强其在口腔癌临床前模型中的治疗效果。我们选择脂质体配方是基于Ji等人的研究 [32]，该研究表明10:1的N/P（胺:磷酸盐）比例可实现最高的CDN封装效率。添加了DMG-mPEG-2000以防止脂质体之间的聚集，使用氢化大豆胆碱作为辅助脂质，胆固醇用于维持膜稳定性。
结论 在携带ROC1肿瘤的小鼠模型中，多次注射CDN后观察到肿瘤消退，我们假设生物材料方法可以延长CDN的释放时间，从而最终减少肿瘤消退所需的剂量。我们选择了一种电荷匹配的MDP-脂质体复合系统来验证这一假设，并发现了阳离子脂质体在K2 水凝胶中的高负载能力。即使在8:1的高脂质:肽摩尔比下，
CRediT作者贡献声明 约瑟夫·W·R·斯韦恩（Joseph W.R. Swain）： 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、数据管理。安德烈亚·H·莫利纳（Andrea H. Molina）： 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、数据管理、概念化。杰玛琳·M·松加（Gemalene M. Sunga）： 撰写——审阅与编辑、方法学、研究、数据分析、数据管理、概念化。丹妮尔·丘-马丁内斯（Danielle Chew-Martinez）： 撰写——审阅与编辑、方法学、研究。
致谢 这项工作部分得到了NIH NIDCR （R01DE030140和R01 DE030140-S1）和Welch研究基金会（C-2141）的资助。J.W.R.S还获得了国家科学基金会 研究生研究奖学金计划的支持。
