《Journal of Controlled Release》：Carrier-free PANoptosis nanoinducers synergize with immunometabolic reprogramming for enhanced immunotherapy
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免疫细胞死亡诱导的免疫疗法在癌症治疗中潜力巨大，但单一死亡途径易受肿瘤调控机制和免疫抑制微环境影响。本研究开发了一种无载体纳米治疗系统（SN NPs），通过共组装PANoptosis诱导剂（SA）与IDO1抑制剂（NLG919），协同增强肿瘤免疫原性死亡（ICD）和抗肿瘤免疫应答。SN NPs通过触发线粒体功能障碍和过量ROS生成，激活pyroptosis、necroptosis和apoptosis的协同PANoptosis途径，显著放大ICD并促进树突状细胞成熟。同时，IDO1抑制剂通过干扰色氨酸代谢，抑制调节性T细胞（Tregs）增殖，协同增强ICD诱导的免疫激活和抗肿瘤疗效。体外及体内实验证实，SN NPs不仅实现药物缓释和高效递送，还能协同克服免疫抑制屏障，显示出优于单一药物或物理混合物的协同增效作用。
马子琳|李松燕|赵文|刘斌涵|王学春|赵一蕾|宋云轩|焦建伟|张月英|张桂强|段秀英
山东第一医科大学与山东医学科学院生命科学学院医学科技创新中心第一附属医院，中国济南250117
摘要
基于免疫原性细胞死亡（ICD）的免疫疗法在癌症治疗中具有巨大潜力，但单一死亡途径驱动的ICD治疗效果往往受到肿瘤调控机制和免疫抑制性肿瘤微环境的影响而受限。为应对这些挑战，研究人员通过将PANoptosis（一种结合了焦亡、凋亡和坏死过程的炎症性程序性细胞死亡形式）的诱导剂与吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）抑制剂共组装，开发出一种无载体的纳米治疗系统（SN NPs），以增强免疫治疗效果。SN NPs通过引发线粒体功能障碍和过量活性氧（ROS）的产生，诱导了强烈的PANoptosis级联反应，显著增强了ICD效应，促进了树突状细胞的成熟并增强了后续的抗肿瘤免疫反应。同时，共递送的IDO1抑制剂打破了色氨酸代谢介导的免疫抑制，从而协同增强了ICD引发的免疫激活和治疗效果。全面的体外和体内研究表明，该系统具有良好的安全性，并显著激活了抗肿瘤免疫反应，抑制了肿瘤生长。这项工作突显了PANoptosis诱导与免疫代谢重编程结合在增强免疫疗法中的潜力。
引言
肿瘤免疫疗法通过利用患者自身的免疫系统来清除恶性肿瘤，在临床前和临床研究中展现了良好的效果[1]、[2]。然而，由于肿瘤组织本身的低免疫原性和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）[3]、[4]、[5]，强烈的持久免疫反应仍然难以实现。一方面，肿瘤中的高突变率会产生新抗原，这些新抗原无法被树突状细胞（DCs）和其他抗原呈递细胞（APCs）识别，从而阻碍T细胞的招募和激活，导致免疫逃逸[6]、[7]。另一方面，TME中富含免疫抑制性代谢物和免疫抑制细胞，如犬尿氨酸（Kyn）、腺苷、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs），这些因素会抑制T细胞活性和肿瘤内浸润，最终削弱免疫疗法的效果[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。因此，需要制定策略来提高肿瘤的免疫原性并同时逆转免疫抑制，以实现免疫疗法的最大潜力。
诱导肿瘤免疫原性细胞死亡（ICD）是释放肿瘤相关抗原并引发强烈抗肿瘤免疫反应的有效方法之一[13]、[14]、[15]。大量证据表明，焦亡、铁死亡、凋亡等多种死亡方式都可以在肿瘤细胞中引发ICD[3]、[16]、[17]。然而，单一死亡途径驱动的ICD的免疫刺激效果常因肿瘤内在的程序而减弱，包括细胞周期重编程、细胞修复过程和分子调控机制[18]、[19]。因此，人们探索了多种程序性细胞死亡（PCD）方式的组合诱导以提高肿瘤的免疫原性；然而，不同死亡途径之间的机制差异限制了简单组合难以产生真正的协同抗肿瘤免疫效果。幸运的是，新兴的PANoptosis概念为多模式免疫原性死亡提供了一种有前景的策略。PANoptosis是一种由焦亡、凋亡和坏死共同作用引发的炎症性PCD，其效应不能仅用其中任何一种机制来解释[20]、[21]、[22]、[23]。PANoptosis可以触发死亡肿瘤细胞释放大量的损伤相关分子模式（DAMPs），从而驱动强烈的ICD并引发肿瘤特异性免疫反应[24]、[25]、[26]。因此，利用PANoptosis已成为触发高效ICD基础免疫疗法的有效策略。
TME中的免疫抑制细胞，尤其是Tregs，会大大削弱ICD引发的免疫反应[27]、[28]。异常的肿瘤代谢常常上调吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）的表达，该酶将色氨酸（Trp）转化为犬尿氨酸（Kyn）[29]、[30]、[31]。Trp的减少会抑制T细胞的激活和增殖，而Kyn的增加则会促进Tregs的生成并巩固免疫抑制环境[32]、[33]、[34]、[35]、[36]。因此，将PANoptosis诱导与IDO1抑制相结合是一种增强抗肿瘤免疫的合理策略。最近的研究表明，磺康唑（SA）可以通过引发氧化应激相关的线粒体功能障碍和破坏细胞代谢来有效诱导PANoptosis[37]。此外，选择性IDO1抑制剂NLG919已被广泛研究用于缓解犬尿氨酸介导的免疫抑制并减少Treg的数量[38]、[39]、[40]。然而，小分子PANoptosis诱导剂和IDO1抑制剂由于水溶性差、半衰期短、细胞渗透性低以及由此导致的生物利用度低和脱靶毒性等问题而受到严重限制[41]、[42]。
为克服这些障碍，人们设计了多种纳米平台以增强药物生物利用度并降低全身毒性[43]、[44]、[45]。其中，无载体纳米颗粒因其制备简单、载药能力强且消除了载体相关效应而受到特别关注[46]、[47]。本文中，我们利用金属配位和多种非共价相互作用，从PANoptosis诱导剂SA和NLG919制备了无载体纳米颗粒（称为SN NPs）（图1A）。这种集成纳米系统能够同时提高肿瘤的免疫原性并逆转TME中的免疫抑制，从而显著增强抗肿瘤免疫疗法的效果。SN NPs表现出优异的胶体稳定性、高载药量，并能在TME中特异性释放SA和NLG919。解体后，SA能引发强烈的PANoptosis和ICD效应，而NLG919则阻断IDO1介导的色氨酸代谢，抑制Treg的扩增并协同增强细胞毒性T细胞的活性。总体而言，SN NPs引发了PANoptosis，激活了抗肿瘤免疫反应，并重塑了TME，增强了抗肿瘤效果（图1B）。与游离药物相比，SN NPs不仅实现了更好的细胞摄取和可控的药物释放，还通过“一体化”设计协同克服了免疫抑制障碍。值得注意的是，体外和体内评估均证实，制备的NPs比游离SA或其与NLG919的物理混合物具有显著更好的治疗效果，表现出明显的“1 + 1 > 2”协同效应。
部分内容摘要
纳米颗粒的制备
制备SN NPs时，将1.13 mg的NLG919加入100 μL乙醇中，0.66 mg的SA加入100 μL二甲基亚砜（DMSO）中，35 μL 40 mM的CuCl2水溶液，然后加入含有1 mg BSA的1 mL蒸馏水。混合物在400 rpm下搅拌5分钟，室温下静置12小时，最后以12000 g离心5分钟以收集SN NPs。
ISN NPs的制备工艺与SN NPs类似，不同之处在于额外添加了0.5 mg的ICG。
SN NPs的制备与表征
SN NPs通过Cu2+配位和SA与NLG919之间的非共价相互作用进行了一步自组装。随后加入牛血清白蛋白（BSA）以进一步稳定和均化分散液。透射电子显微镜（TEM/SEM）图像显示，这些纳米颗粒呈均匀球形，平均直径约为250 nm（图1A和B）。动态光散射（DLS）分析显示其平均水动力直径为263.9 ± 1.5 nm。结论
总结来说，我们合理设计并验证了一种无载体纳米颗粒系统，该系统作为乳腺癌治疗的强效PANoptosis诱导剂。通过引发线粒体功能障碍和过量ROS的产生，这些纳米颗粒同时激活了焦亡、坏死和凋亡。c-caspase-3、GSDMD-N和p-MLKL等标志蛋白的上调证实了PANoptosis的强烈诱导。值得注意的是，这种PANoptosis级联反应显著增强了ICD效应，促进了树突状细胞的激活。
作者贡献声明
马子琳：撰写初稿、项目管理、方法学设计、数据分析。李松燕：方法学设计、实验研究、数据管理。赵文：方法学设计、实验研究。刘斌涵：数据可视化、实验研究。王学春：方法学设计、实验研究。赵一蕾：项目管理、实验研究。宋云轩：实验研究。焦建伟：撰写、审稿与编辑、监督。张月英：撰写、审稿与编辑、监督。张桂强：撰写——致谢
本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2025MS323, ZR2023MB081）、国家自然科学基金（32300588）以及山东第一医科大学与山东医学科学院医学科技创新中心的大规模仪器设备共享基金（KCZX2024A008, KCZX2024A012）的支持。
