氯功能化纳米羟基磷灰石涂层通过调控宿主-细菌竞争增强牙周炎患者即刻种植骨整合

《MedComm – Biomaterials and Applications》：Chlorine-Functionalized Nano-Hydroxyapatite Coatings Enhance Osseointegration in Immediate Implantation by Modulating Host–Bacteria Competition

本综述聚焦于牙周炎患者即刻种植术后的关键挑战——种植体表面宿主细胞与致病菌的早期竞争。研究通过微弧氧化与阳极氧化技术，构建了集成了纳米羟基磷灰石（nHA）与氯化物（Cl-）的MAO(Ti)-nHA-Cl复合涂层。该涂层可持续释放低剂量次氯酸（HClO）抑制细菌黏附，同时显著促进成骨细胞分化与矿化。体内外实验证实，该策略可双向调节种植体-骨界面微环境，降低术后感染风险并促进新骨形成，为即刻种植的功能化表面设计提供了新思路。

　　

引言

钛及钛合金因其优异的机械性能、高耐腐蚀性和良好的生物相容性，被广泛应用于血管支架、牙种植体、颅骨重建装置、骨折内固定系统等领域。然而，与传统骨组织相比，钛种植体存在骨整合时间长、生物功能耦合有限、组织诱导能力不足等问题。在即刻种植中，植入后的早期阶段尤为关键，宿主细胞与致病菌在种植体表面竞争激烈。对于牙周炎患者，术后感染风险显著升高，因此开发能够主动调节宿主-细菌竞争、促进功能细胞优先定植并抑制细菌侵袭的钛表面改性策略，已成为生物材料领域的重要方向。纳米级改性，特别是纳米羟基磷灰石（nHA，Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）因其出色的生物相容性、显著的生物活性和优异的骨传导性而备受关注。然而，许多生物活性涂层对细菌的易感性高于纯钛，而传统的抗生素或金属离子抗菌策略存在耐药性或细胞毒性风险。为此，本研究提出了一种新颖的策略，在种植体表面同时引入具有骨诱导性的nHA和具有抗菌功能的氯离子（Cl^-），旨在构建一种MAO(Ti)-nHA-Cl复合涂层，在术后早期实现对宿主-细菌竞争的主动调控。

结果

2.1 MAO(Ti)-nHA-Cl涂层的表征

扫描电子显微镜观察显示，纯钛样品表面相对光滑。经过微弧氧化处理后，样品表面呈现出典型的火山口状微孔结构。羟基磷灰石颗粒均匀沉积在孔壁和间隙中。而MAO(Ti)-nHA-Cl样品保留了MAO的多孔结构特征，孔周围可观察到絮状沉积物和不规则片状层，表面形态更为复杂。

能量色散谱分析证实了Cl和P元素在涂层表面的均匀分布。X射线光电子能谱分析显示，涂层表面含有钛、碳、氧、氯、钠、钙和磷。Cl 2p谱在199.1 eV处有一个明显的峰，表明氯以氯离子形式稳定存在。水接触角测量表明，MAO(Ti)、MAO(Ti)-nHA和MAO(Ti)-nHA-Cl具有较低的接触角，亲水性增强。体外药物释放曲线显示，该涂层表现出可控的缓释行为，大部分HClO在最初24小时内释放，之后逐渐趋于平稳，稳定释放水平可持续7天。

2.2 改性钛表面的体外细胞相容性

通过钛提取物与细胞的共培养系统评估生物材料的细胞相容性。实验使用具有强成骨分化能力的小鼠胚胎颅骨前成骨细胞MC3T3-E1。结果显示，在100 mg/mL NaCl电解质浓度下制备的钛样品在72小时内显著增强了MC3T3-E1细胞增殖。细胞活力测定进一步表明，MAO(Ti)、MAO(Ti)-nHA和MAO(Ti)-nHA-Cl组在共培养1、3、5天后，细胞活性均高于对照组。

2.3 MAO(Ti)-nHA-Cl涂层的抗菌测试

采用平板菌落计数法评估涂层的抗菌活性。结果显示，在关键的早期24小时内，与Ti、MAO(Ti)和MAO(Ti)-nHA组相比，MAO(Ti)-nHA-Cl涂层强烈抑制了细菌的黏附和增殖，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌落形成单位减少具有统计学显著性，抑菌率分别达到47.78%和42.87%。

共聚焦激光扫描显微镜图像显示，Ti组表面覆盖大量绿色活菌和少量红色死菌，而MAO(Ti)-nHA-Cl组活菌数量显著减少，红色死菌明显增多，表明其表面具有强杀菌活性。

2.4 MAO(Ti)-nHA-Cl涂层诱导的体外成骨分化

在第7天和第14天进行碱性磷酸酶染色和半定量分析。在所有组中，MAO(Ti)-nHA-Cl组在两个时间点都表现出最明显的染色和最多的ALP阳性细胞，显示出最佳的成骨性能。MAO(Ti)-nHA组表现次之，明显优于MAO(Ti)和Ti对照组。茜素红S染色和半定量分析显示，在第21天，MAO(Ti)-nHA-Cl和MAO(Ti)-nHA组与MAO(Ti)和Ti组相比，钙沉积更多，MAO(Ti)-nHA-Cl组的促进作用最强。

定量实时聚合酶链式反应结果显示，MAO(Ti)-nHA-Cl组中RUNX2、COL1A、BMP2和骨保护素的表达相对于对照组显著上调，表明成骨能力增强。

2.5 MAO(Ti)-nHA-Cl涂层的体内评价

建立大鼠股骨即刻种植感染模型。植入4周后，通过微计算机断层扫描三维重建和定量分析种植体周围骨结构。定量分析表明，MAO(Ti)-nHA-Cl组在骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度方面均优于其他组。

主要器官的组织学分析显示，植入Ti、MAO(Ti)-nHA和MAO(Ti)-nHA-Cl种植体4周后，大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织结构完整，未见明显的组织损伤或炎性细胞浸润，三组间无显著组织学差异。苏木精-伊红染色显示，在术后1周这一关键时间点，Ti组种植体周围出现明显的炎症和骨组织损伤，周围有大量炎性细胞。相比之下，MAO(Ti)-nHA和MAO(Ti)-nHA-Cl组的炎性细胞明显减少。到第4周，MAO(Ti)-nHA和MAO(Ti)-nHA-Cl组种植体周围的新骨面积显著增加，种植体-骨界面未见纤维组织浸润，表明骨整合成功；其中MAO(Ti)-nHA-Cl组的骨形成更为广泛。

Masson三色染色进一步支持了H&E染色结果，显示两组在4周时种植体周围有大量胶原积累。以骨钙素作为成骨标志物，肿瘤坏死因子和白细胞介素-1作为关键炎症指标进行评估。结果显示，在术后4周，MAO(Ti)-nHA和MAO(Ti)-nHA-Cl组的骨钙素阳性区域明显大于Ti组。此外，在术后1周，MAO(Ti)-nHA-Cl和MAO(Ti)-nHA组中肿瘤坏死因子和白细胞介素-1的表达水平低于Ti组，阳性染色区域也较少，突出了其在第一个24小时窗口期的早期抗炎和抗菌协同作用。

讨论

本研究证明，氯功能化纳米羟基磷灰石复合涂层可在即刻种植早期显著促进骨整合并抑制细菌黏附。观察到的抗菌效果主要归因于阳极氧化过程中形成的Ti–Cl微结构。XPS分析证实了TiO₂和TiCl₃的存在，表明Ti–Cl结构可持续释放微量的次氯酸，通过氧化作用破坏细菌细胞壁，并在关键的术后早期减少细菌定植。此外，增强的表面润湿性也可能通过竞争性排斥间接抑制细菌黏附。本研究中掺入的nHA在增强即刻种植术后关键早期阶段的成骨能力方面发挥了关键作用。nHA与成骨细胞的相互作用可激活骨形态发生蛋白及其下游的Smad信号通路，上调Runx2和ALP等关键转录因子。nHA的粒径和形貌在调节早期成骨分化中起着关键作用。较小的nHA颗粒因其更高的比表面积，提供了更多的活性位点，增强了与成骨细胞的生物相互作用。针状nHA颗粒比其他形态更能诱导成骨基因的强烈上调。nHA表面通过激活涉及HDAC1、ADD1、CDK5和AKT等信号因子的磷酸化途径促进早期分化。此外，nHA还通过多种信号通路发挥其生物学功能，特别是ERK和p38 MAPK级联反应。通过整合素介导的细胞外基质信号，nHA可以激活ERK通路，增强I型胶原和骨钙素等成骨标志物的表达。同时，p38 MAPK通路对于成骨细胞的增殖和分化至关重要。最近的研究表明，nHA修饰的材料通过激活p38通路显著增强了BMP-2的表达。除了优异的骨诱导特性外，nHA还可以通过调节免疫微环境发挥抗炎作用，促进巨噬细胞从促炎的M1表型向促再生的M2表型极化。因此，MAO(Ti)-nHA-Cl涂层中nHA的免疫调节功能可能有助于早期抗炎反应，并与Cl^-的抗菌特性协同作用，优化术后微环境。与以往的研究相比，本工作提出的氯功能化界面展现了一种独特的生物调节机制。MAO(Ti)-nHA-Cl涂层不仅抑制细菌黏附，还促进早期成骨细胞定植，实现了“时间敏感的生物学竞争调控”的概念。当然，本研究也存在一些局限性。动物实验使用了大鼠股骨模型，不能完全复制口腔复杂的微生物环境和机械负荷。尽管对HClO的体外释放曲线进行了表征，但其体内释放动力学和安全剂量范围仍需要通过长期的体内和临床研究来探索。

结论

本研究成功制备了一种集成了纳米羟基磷灰石与钛-氯结构的MAO(Ti)-nHA-Cl复合涂层。该涂层保留了微/纳米多孔结构，并表现出增强的表面亲水性。体外实验证明了其优异的细胞相容性，促进了MC3T3-E1细胞的黏附、成骨分化和矿化基质沉积，并显著上调了包括Runx2、COL1A和BMP2在内的成骨相关基因。值得注意的是，Ti–Cl结构可持续释放低剂量的次氯酸，有效抑制口腔致病菌的黏附和增殖，从而调节宿主细胞与细菌之间关键早期阶段的竞争。在大鼠股骨感染模型中，该涂层减少了炎症反应并促进了新骨形成。总之，这些结果表明，MAO(Ti)-nHA-Cl涂层为抗菌和成骨调节提供了一个协同平台，在术后早期窗口期选择性促进有益细胞黏附，同时抑制细菌定植，最终改善骨整合。这一策略为牙种植体表面的功能化，特别是针对接受即刻种植的牙周炎患者，提供了一种有前景的途径。

材料与方法

研究使用四级商业纯钛。通过微弧氧化在含有钙乙酸酯、甘油磷酸钠、氢氧化钠和nHA的电解液中处理钛样品。随后，MAO(Ti)-nHA样品在100 mg/mL NaCl溶液中进行阳极氧化。通过场发射扫描电子显微镜、能量色散X射线光谱仪、X射线光电子能谱和接触角测量仪对涂层进行表征。通过DPD比色法测定体外释放。通过平板菌落计数法和活/死细菌染色评估抗菌活性。使用MC3T3-E1细胞评估细胞活力、ALP活性、茜素红S染色，并通过qRT-PCR分析成骨基因表达。建立大鼠股骨即刻种植感染模型，通过Micro-CT、H&E染色、Masson染色和免疫组化进行体内评价。所有实验均进行三次或以上重复，数据采用GraphPad Prism进行分析。