《Materials Today Bio》：Charge/stiffness-tunable nano-microsphere overcomes intestinal mucosal barrier for rheumatoid arthritis treatment
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本论文针对类风湿关节炎(RA)口服治疗中存在的肠道吸收差、生物利用度低等难题，研究人员开发了一种电荷和刚度可动态调控的纳米微球系统(MLV@MS)。该系统通过独特的非经典水解途径实现电荷反转，有效穿透肠黏膜和上皮屏障，显著提升了甲氨蝶呤(MTX)的肠道转运效率和血药浓度，在动物模型中展现出优越的抗炎和抗RA疗效，为口服纳米药物治疗慢性疾病提供了新策略。
类风湿关节炎（RA）是一种折磨全球数百万患者的慢性自身免疫性疾病，其核心特征是关节的慢性滑膜炎，导致疼痛、肿胀甚至关节畸形。在临床上，改善病情的抗风湿药物（DMARDs），尤其是甲氨蝶呤（MTX），是口服治疗RA的基石。然而，口服MTX的疗效常常“大打折扣”，原因是它难以有效穿越人体肠道的多重屏障。我们的肠道并非一条简单的管道，其内壁覆盖着带负电荷、具有粘度梯度的粘液层，之下是功能强大的上皮细胞层，它们不仅能选择性降解药物，还能通过外排泵（如P-gp）将药物“赶出去”。这导致了MTX口服吸收差、生物利用度低，并且常常伴随着明显的副作用。尽管脂质体等纳米药物有望提高药物稳定性，但传统纳米颗粒难以在同一递送过程中适应粘液层和上皮层对颗粒表面电荷、机械刚度截然不同的要求。因此，设计一种能够“智能”地、动态地调节自身电荷和刚度，以“闯过”肠道重重关卡的纳米药物，成为攻克口服RA药物递送难题的关键策略。
为了应对这一挑战，来自宁波大学的研究团队在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究。他们巧妙地构建了一种“电荷/刚度可调”的纳米微球系统，成功克服了肠黏膜屏障，显著提升了RA的治疗效果。这项研究为解决口服纳米药物递送中的关键瓶颈提供了全新的思路和技术平台。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析新型磷脂衍生物二青蒿琥酯磷脂酰胆碱（DAPC）在人工肠液（AIF）中的非经典水解机制。2. 通过水/油/水（W/O/W）双重乳液法结合自组装技术，制备了负载MTX、具有“洋葱状”多层结构的多层囊泡（MLVs）。3. 采用气体微流控技术，将MLVs封装于pH敏感的钙藻酸盐水凝胶微球中，构建最终的纳米微球（MLV@MS）。4. 综合运用冷冻电镜（Cryo-EM）、动态光散射（DLS）、原子力显微镜（AFM）表征纳米颗粒的结构、尺寸、电位及机械性能。5. 通过体外细胞实验（Caco-2, RAW264.7, MH7A细胞）、离体肠道模型、佐剂诱导关节炎（AIA）大鼠模型及16S rRNA肠道菌群测序，系统评估了该递送系统的穿透效率、抗炎活性、体内药效及安全性。
研究结果：
LC-MS/MS分析DAPC以检测水解机制
研究人员首先深入探究了核心材料DAPC的水解行为。LC-MS/MS分析发现，DAPC在人工肠液中发生了一种不同于传统磷脂sn-1/sn-2位点水解的“非经典水解”。该过程导致DAPC脂链末端羧基化，从而使其所组成的囊泡表面电荷能从正电反转为负电。这一独特的电荷反转能力是后续构建动态适应性纳米载体的基础。
用DAPC制备电荷/刚度可调的MLVs
基于DAPC的特性，研究团队构建了MLVs。该结构内部是由高相变温度磷脂DSPC和高胆固醇构成的高刚度、近中性/负电荷的小单层脂质体（SUV）核心，外部则是由DAPC、正电荷磷脂DOTAP和细胞穿膜肽TAT修饰的磷脂共同自组装形成的柔性、正电荷外壳。冷冻电镜图像清晰显示了其“洋葱状”多层结构。动态光散射和原子力显微镜表征证实，MLVs的粒径分布更稳定，且其杨氏模量（表征刚度）可随时间在人工肠液中从约0.5 MPa增至约2 MPa，实现了刚度的动态上调。同时，其zeta电位在数小时内从约+20 mV降至近中性，实现了电荷的动态反转。
用钙藻酸盐微球封装制备纳米微球
为解决MLVs在储存和递送过程中的不稳定性，研究人员利用气体微流控技术将MLVs封装于钙藻酸盐水凝胶微球中，形成MLV@MS。扫描电镜和光学显微镜显示微球形貌规整。体外模拟消化实验表明，MLV@MS在人工胃液（AGF）中稳定，而在人工肠液（AIF）和人工结肠液（ACF）中能快速崩解并释放MLVs，实现了药物的肠道定位释放。
In vitro细胞毒性试验和细胞摄取研究
细胞活性实验表明MLV@MS无明显细胞毒性。流式细胞术和激光共聚焦显微镜结果显示，与对照组囊泡（CV）相比，MLVs被肠道上皮细胞Caco-2摄取的效率显著更高。内吞抑制实验表明，MLVs的细胞摄取涉及网格蛋白、小窝蛋白和动力蛋白依赖的多重机制，具有经细胞转运的潜力。
Ex vivo肠道屏障转运效率评估
利用离体大鼠小肠模型评估MLV@MS的穿透能力。免疫荧光切片显示，MLV@MS处理后，荧光标记的MLVs能有效分布至小肠黏膜下层。将孵育后的外液再与Caco-2细胞共培养，MLV@MS组细胞显示出更强的荧光信号，证明其具有优越的跨肠屏障转运和递送效率。
In vitro抗RA活性
在细胞层面评估抗RA效果。划痕实验表明，MLV@MS能有效抑制滑膜成纤维细胞MH7A的迁移。在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞RAW264.7中，MLV@MS能促进巨噬细胞由促炎的M1型向抗炎的M2型极化，并显著降低白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子的mRNA和蛋白表达水平。转录组测序进一步证实，MLV@MS能逆转LPS诱导的炎症相关基因表达，并抑制TNF、IL-17等关键炎症信号通路。
In vivo评估肠道屏障转运效率
体内成像显示，口服MLV@MS后，荧光信号在肠道（尤其是小肠）富集，且强度显著高于对照组。药代动力学实验表明，口服MLV@MS的MTX最大血药浓度（Cmax）达到约120 ng/mL，分别是游离MTX和CV@MS的1.6倍和1.5倍，半衰期（t1/2）也显著延长。这证实了MLV@MS能极大增强MTX的肠道吸收和系统暴露。
In vivo评估抗RA有效性和安全性
在佐剂诱导关节炎（AIA）大鼠模型中，口服MLV@MS治疗能显著改善大鼠的关节炎临床评分、减轻爪肿胀、抑制滑膜增生和骨侵蚀。踝关节组织的免疫组化显示IL-1β和TNF-α表达被显著抑制。同时，治疗期间大鼠的肝肾功能指标及主要脏器病理切片均未见异常，证明了该系统的安全性。
16S rRNA测序分析肠道菌群
16S rRNA测序分析表明，口服MLV@MS能够调节AIA模型大鼠紊乱的肠道菌群，使其结构向健康组靠近，增加了毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）等有益菌的丰度，减少了与炎症相关的细菌。这提示MLV@MS的治疗效果可能部分得益于其对肠道微生态的积极调节。
结论与讨论：
本研究成功构建了一种集“电荷反转”、“刚度调节”和“肠道定位释放”于一体的智能纳米微球口服递送系统（MLV@MS）。其核心创新在于利用DAPC的非经典水解特性，使多层囊泡（MLVs）能在肠道转运过程中动态地“脱下”柔性的正电荷外壳，“露出”刚性的近中性内核，从而依次适配粘液层穿透和上皮细胞跨膜转运的不同物理化学要求。钙藻酸盐微球的封装则像“保护舱”一样，确保了MLVs在到达肠道前的结构稳定。
该系统如同一艘能够根据水域（肠道环境）变化而自动调整船体（电荷、刚度）的“智能潜艇”，高效穿越了肠道的“黏液暗礁”和“上皮旋涡”，将治疗药物MTX精准送达全身。体内外实验充分证明，MLV@MS能显著提升MTX的口服生物利用度，在RA动物模型中表现出卓越的抗炎和关节保护疗效，且具有良好的生物安全性。此外，该系统还能有益地调节肠道菌群。
这项工作不仅为RA的口服治疗提供了一种极具前景的新策略，更重要的是，它为解决口服纳米药物面临的共性递送壁垒——即如何让同一纳米颗粒动态适应体内不同生物屏障的差异性要求——提供了一个普适性的设计思路和技术平台。未来，该平台有望拓展用于胰岛素、单克隆抗体等生物大分子及其他慢性疾病治疗药物的口服递送，具有广阔的临床转化前景。
