在Actinobacillus pleuropneumoniae中，dppA1A2BCDF基因编码一种假定的ABC转运蛋白：其在谷胱甘肽利用、氧化应激耐受性和毒力中的作用

《Microbial Pathogenesis》：Characterization of the dppA1A2BCDF genes encoding a putative ABC transporter in Actinobacillus pleuropneumoniae: Role in glutathione utilization, oxidative stress tolerance and virulence

该研究通过构建副溶血性链球菌（A. pleuropneumoniae）的dppA1A2BCDF ABC转运蛋白家族缺失突变株和互补菌株，揭示了该转运蛋白系统在硫代谢中的作用及其对致病性的影响。结果显示ΔdppA1A2-1突变体在GSH利用和抗氧化能力方面存在缺陷，但其在猪体内的致病性并未减弱，说明dppA1A2BCDF主要参与硫代谢而非直接调控病原体毒力。

　　

许欢|肖娟|李卓|胡汉文|严飞|齐超|刘金林

教育部农药与化学生物学重点实验室，华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北重点实验室，中国湖北省武汉市430079

摘要

Actinobacillus pleuropneumoniae是一种属于Pasteurella属的革兰氏阴性细菌。由A. pleuropneumoniae引起的猪胸膜肺炎是猪的主要呼吸道疾病，给全球养猪业造成了重大经济损失。硫是所有生命形式必需的营养素，而谷胱甘肽（GSH）可作为A. pleuropneumoniae生长的替代硫源。本研究探讨了潜在的ABC转运蛋白家族成员(dppA1A2BCDF)在硫利用和A. pleuropneumoniae毒力中的作用。我们生成并表征了单基因缺失突变体ΔdppA1和ΔdppA2、双基因缺失突变体ΔdppA1A2-1和ΔdppA1A2-2以及trans-互补株CA1、CA2和CA1A2。结果表明，在仅以GSH为硫源的化学定义培养基中，ΔdppA1A2-1的生长受到抑制，并且对氧化应激的敏感性增加。相比之下，保留了dppA1和dppA2之间164 bp序列的ΔdppA1A2-2表现出与野生型相似的表型。动物感染实验表明，尽管ΔdppA1A2-1的GSH利用能力和抗氧化能力受损，但在猪体内的致病性并未减弱。综上所述，这些结果表明dppA1A2BCDF参与了GSH的利用，而GSH的缺乏可能会增加氧化敏感性，但并非该病原体毒力的必需因素。这些发现进一步揭示了硫同化过程的复杂调控机制及其在A. pleuropneumoniae感染中的重要性。

引言

Actinobacillus pleuropneumoniae是猪胸膜肺炎的致病菌，这是一种具有高发病率和死亡率的传染性呼吸道疾病，给养猪业带来了巨大损失[1]。目前尚不完全清楚A. pleuropneumoniae感染的发病机制。先前的研究表明，多种毒力因子通过促进宿主定植、逃避宿主免疫反应和引发疾病而发挥作用[2]。全面了解A. pleuropneumoniae的生物学和致病特性对于开发更有效的控制策略至关重要。

虽然细菌能够合成多种有机分子，但可靠的营养素摄入对其生存、繁殖和定植至关重要[3]。硫作为生命活动的重要组成部分，在多种生物功能中起着关键作用[4]。大多数微生物将硫转化为半胱氨酸和甲硫氨酸，这些是谷胱甘肽（GSH）、泛酸、生物素、铁硫化合物、硫辛酸等含硫化合物的前体[5]。此外，先前已有研究证明硫营养素的吸收和代谢在细菌感染中的重要性[6],[7]。

GSH是最丰富的细胞内非蛋白质硫醇，它在多种细胞过程中发挥着关键作用，尤其是在维持许多生物体的氧化还原平衡方面[8]。研究表明，GSH通过调节毒力基因表达、生物膜形成、硫化氢产生以及调节宿主免疫反应来影响细菌的致病性[9]。Escherichia coli K-12中的yliABCD操纵子编码了首个被发现的细菌GSH转运蛋白；该操纵子的突变会导致在仅以GSH为硫源的最简单培养基上的生长严重受阻[10]。在Haemophilus influenzae中，GSH的转运由周质结合蛋白HbpA与ATP结合盒（ABC）型二肽转运蛋白DppBCDF共同完成[11]。此外，Pasteurellaceae家族中的其他HbpA类似蛋白也被发现参与谷胱甘肽的内膜转运[12]。在A. pleuropneumoniae中，已鉴定出两种HbpA类似蛋白HbpA1和HbpA2参与GSH的获取。然而，缺乏HbpA1或HbpA2的突变体仍能在仅以GSH为硫源的化学定义培养基（CDM）中缓慢生长[13]，这表明该细菌的GSH利用过程中还涉及其他成分。生物信息学分析在A. pleuropneumoniae中鉴定出一个潜在的ABC转运蛋白操纵子dppA1A2BCDF（图S1）。该操纵子可能编码两种周质结合蛋白（DppA1和DppA2）、两种内膜成分（DppB和DppC）以及两种ATP结合成分（DppD和DppF）。推导出的周质结合蛋白DppA1和DppA2与其他HbpA家族蛋白具有高度序列相似性。在本研究中，我们探讨了这一潜在ABC转运蛋白在A. pleuropneumoniae的硫营养素获取和感染中的作用。

细菌菌株、引物和质粒

本研究中使用的细菌菌株、质粒和引物列于表1中。A. pleuropneumoniae菌株在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA；Dickinson and Company，美国新泽西州Franklin Lakes）或胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中培养，培养基中添加了10 μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺；Sigma，美国密苏里州St. Louis）和5%胎牛血清（Gibco BRL，美国纽约州Grand Island）。在需要选择A. pleuropneumoniae突变体时，还添加了2 μg/mL氯霉素和5%（m/v）蔗糖

鉴定A. pleuropneumoniae中的两种潜在谷胱甘肽转运蛋白

基于与H.influenzae HbpA的蛋白质相似性，通过全基因组筛选在A. pleuropneumoniae中鉴定出了由dppA1和dppA2基因编码的两种HbpA类似蛋白DppA1和DppA2，这些基因位于一个潜在的ABC转运蛋白操纵子dppA1A2BCDF中。分析了DppA1和DppA2与几种已知HpbA类似蛋白（如H.influenzae的HbpA、Salmonella enterica的YliB、Haemophilus parasuis的GbpA和E.coli的GsiB）的相似性。如表S1所示，DppA1表现出

讨论

A. pleuropneumoniae会引起猪胸膜肺炎，导致严重的肺部损伤。此外，这种侵袭性细菌的持续感染会减缓育肥猪的生长速度。多种因素，如细胞外糖萼屏障、抗氧化酶和铁吸收蛋白，已被认为参与了A. pleuropneumoniae在猪体内的定植过程。然而，识别出参与这些过程的额外因素将有助于我们更深入地理解这种感染机制

CRediT作者贡献声明

胡汉文：验证、实验研究。齐超：监督、资金获取。严飞：数据分析。许欢：初稿撰写、实验研究、数据管理。刘金林：撰写-审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。李卓：验证、实验研究、数据管理。肖娟：验证、实验研究、数据管理

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢澳大利亚初级产业与渔业动物研究所的Pat Blackall博士慷慨捐赠了A. pleuropneumoniae WF83菌株，感谢德国汉诺威兽医大学传染病系的Gerald-F. Gerlach博士捐赠了E. coil β2155菌株和transconjugation质粒pEMOC2，以及瑞士伯尔尼大学兽医细菌学研究所的Joachim Frey博士赠送的穿梭质粒