综述：用于环境ARG监测的等温扩增核酸生物传感器：原理、平台及现场应用准备

《Microchemical Journal》：Isothermal-amplified nucleic acid biosensors for environmental ARG monitoring: principles, platforms, and field readiness

抗生素耐药基因（ARG）环境检测需高效便捷方法，等温核酸扩增（INA）生物传感器因无需复杂热循环成为研究热点。本文系统梳理了酶辅助（如LAMP、RPA）和非酶辅助（如HCR、CHA）两类INA生物传感器的原理、CRISPR/Cas系统耦合策略及环境应用场景，对比荧光与电化学检测性能，指出当前技术灵敏度、抑制剂耐受性及设备便携性不足的挑战，提出通过优化耦合技术、降低研发成本、提升复杂基质适应性等方向推动环境ARG检测的POCT应用。

　　

陆青|常宇|周宇|李卫英

同济大学环境科学与工程学院，上海200092，中国

摘要

随着抗生素耐药性问题日益严重，对即时检测耐药基因的需求也在不断增加。等温核酸扩增生物传感器因其高效性和便捷性而受到广泛关注。在这篇综述中，我们总结了这类生物传感器在过去二十年中的发展历程，将其分为酶辅助型和无酶型两类，并系统分析了它们的工作原理、与CRISPR/Cas系统的结合策略以及在环境抗生素耐药基因（ARG）检测中的实际应用。此外，我们还根据生物传感器的结构组成，比较了不同检测系统（如荧光法和电化学法）在各种应用场景下的性能、优缺点。近年来，包括CRISPR/Cas系统、DNA酶和适配体在内的耦合技术得到了深入发展，使得基于等温核酸扩增策略的生物传感器能够实现阿托摩尔级别的检测灵敏度。大量研究表明这些方法可以在几分钟内完成检测过程，显示出实时或近实时检测的潜力。然而，作为一种新兴技术，这些生物传感器在应对复杂环境基质、降低研发成本以及提高设备多功能性方面仍面临诸多挑战。因此，本文建立了一个系统的比较框架，从灵敏度、抗抑制剂能力和操作复杂性等方面评估了酶辅助型和无酶型等温扩增策略在环境ARG检测中的表现。同时，它也起到了连接技术进步与环境应用需求之间的桥梁作用，重点探讨了如何应对复杂环境基质和现场部署所带来的独特挑战。

引言

自1928年抗生素被发现以来，世界进入了医疗治疗和保健的新时代[123]。然而，抗生素的滥用导致了一个更为严重的全球性问题：细菌对抗生素产生了耐药性。据估计，到2050年，全球将有约1000万人死于与抗生素耐药性相关的感染[92]。耐药基因（ARGs）已成为新的污染物[96]。这些基因位于基因组DNA或质粒上，使细菌具备对抗生素的抵抗力。细菌通过多种机制利用这些基因来抵抗抗生素，包括编码抗生素外排泵、修饰受体、使抗生素失活以及减少抗生素的吸收[27]。耐药基因的来源可以分为两大类：一类是天然存在的耐药基因，它们存在于细菌基因组中；另一类是获得性耐药基因，是通过基因突变或抗生素诱导的基因转移等方式由微生物获得的[87]。由于抗生素的滥用和过度使用，获得性耐药基因是当前抗生素耐药性风险如此之高的主要原因。目前，在土壤、水、空气、冰川和肠道微生物群等多种环境介质中都检测到了耐药基因[26]、[97]、[170]。在“同一健康”（One Health）概念的指导下[28]，加强环境中的耐药基因检测和监测对于进一步控制抗生素耐药性的不良影响至关重要。

目前用于检测环境抗生素耐药性的方法主要包括生物培养技术、基于PCR的靶向检测方法以及宏基因组测序等分子生物学手段[59]、[84]。尽管上述方法已经建立了成熟的检测方案，PCR也被视为耐药基因检测的“金标准”[113]，但传统的细菌培养方法耗时且操作繁琐，且结果可能受到可存活但无法培养（VBNC）病原体的影响。分子生物学基因检测技术需要昂贵的设备、专业的人员和复杂的程序，因此不适合在现场进行高效检测（POCT）。因此，迫切需要探索更灵敏、更特异、更快更简单的耐药基因检测方法。

生物传感器是一种将生物识别元件与信号转导机制结合的分析装置[90]。其工作原理是利用生物敏感材料（如酶、抗体、微生物、细胞、核酸和其他生物活性物质）来识别目标分析物的组成、结构和浓度。这些元件被整合到一个系统中，该系统采用适当的信号放大设备和物理化学转换器，将难以检测的物质转化为可测量或量化的信号分子[47]。生物传感器技术融合了多个学科的优势，如高灵敏度和特异性，使其成为原位应用、实时监测和环境健康成本效益分析的宝贵工具[47]。目前，它已被广泛应用于水、空气和土壤中的污染物监测[34]、[52]、[99]、[116]。

近年来，基于等温核酸扩增（INA）的生物传感器因其出色的可编程性、良好的生物相容性和易于化学合成而受到关注。相关研究日益丰富和深入。等温核酸扩增根据反应过程中是否使用酶分为两类：酶辅助型方法包括环介导等温扩增（LAMP）[91]、链置换扩增（SDA）[40]和重组酶聚合酶扩增（RPA）[95]；而无酶型方法则主要基于杂交链反应（HCR）[29]和催化发夹组装（CHA）[147]。与传统PCR相比，这些生物传感器中的等温扩增策略不需要复杂的热循环过程，具有设备操作简单和技术要求较低等优点。它们已在医学、农业和食品科学等领域得到广泛应用[89]、[103]、[163]。尽管这些方法具有广阔的应用前景，但由于复杂的预处理程序和相对较高的成本，其在环境监测中的实际应用仍受到限制[86]。对于环境中的微量核酸分子（如耐药基因），显著放大核酸信号至可检测水平对于提高检测灵敏度和特异性至关重要[48]。因此，有必要总结基于等温核酸扩增策略的生物传感器在环境领域检测耐药基因的现状，并探讨它们所面临的挑战及未来发展方向。

本文旨在系统总结：（1）环境耐药基因污染和检测方法的现状；（2）等温核酸扩增生物传感器的原理和检测方法；（3）不同等温核酸扩增策略在耐药基因检测中的应用；（4）基于等温核酸扩增策略的生物传感器所面临的挑战及未来发展方向。通过对这些新兴生物传感器在环境耐药基因检测中的研究和应用挑战的分析与讨论，为进一步提高耐药基因检测效率提供了参考。

部分内容

环境中耐药基因污染和检测的现状

耐药基因的存在对公共卫生构成了威胁。早在2006年，研究人员就提出应将耐药基因视为一类新的污染物[96]。耐药基因在环境中循环存在，并可通过食物、饮用水、食物链生物累积以及娱乐用水接触等多种途径进入人体。研究表明，耐药基因可以在人体内积累[107]，从而带来潜在的健康风险。

基于等温核酸信号扩增策略的生物传感器原理

生物传感器通常由识别模块、信号转导和放大模块以及检测模块组成[47]。核酸生物传感器各组件的模块化设计使其能够适应多种分析物的检测。此外，对这些模块的调整和组合可以实现不同的检测结果。随着对生物传感器多功能性和效率要求的提高，CRISPR/Cas系统[151]和功能性核酸（FNAs）等手段得到了广泛应用。

等温核酸信号扩增策略在耐药基因检测中的应用

随着人们对环境中耐药基因认识的提高，越来越多的研究人员开始应用等温核酸信号扩增策略来检测这些基因。表2展示了使用等温核酸信号扩增策略检测耐药基因的一些最新研究成果。大多数研究集中在四环素类[62]、[129]、[168]、β-内酰胺类[38]、[43]、[136]、磺胺类[22]等耐药基因类别上。

挑战与前景

本综述强调了环境领域对快速、实时检测耐药基因的迫切需求，以及基于核酸策略的生物传感器的应用前景。然而，由于生物识别的灵敏度和特异性限制、信号通路设计的复杂性、传感器开发的高成本以及生物材料的长期储存稳定性等问题，基于等温核酸信号的生物传感器仍面临诸多挑战。

作者贡献声明

陆青：撰写——综述与编辑、初稿撰写、可视化制作。常宇：撰写——综述与编辑、研究调查。周宇：撰写——综述与编辑、方法学设计。李卫英：撰写——综述与编辑、资源获取、资金申请。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金[资助编号：52470012]和福州高品质饮用水工程项目[资助编号：kh0040020211986]的支持。