利用原位银沉积技术，无需提取即可对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）中的脂多糖进行比色检测

《Microchemical Journal》：Extraction-free colorimetric detection of lipopolysaccharide from Vibrio parahaemolyticus using in situ silver deposition

开发了一种无需提取的银沉积显色法检测革兰氏阴性菌内毒素LPS，通过AgNO3与LPS的氧化还原反应形成特征430 nm吸收峰实现定量分析，灵敏度达50 μg/mL，验证了该方法与SDS-PAGE及免疫印迹的一致性，适用于Vibrio parahaemolyticus等细菌LPS表达的快速评估。

　　

邱俊杰|张晓荣|李帅|潘赛坤|王文斌

中国江苏省海洋大学海洋生物资源与环境重点实验室，连云港222005

摘要

目前，对革兰氏阴性细菌中脂多糖（LPS）表达的分析依赖于耗时且繁琐的提取和检测步骤。在此，我们报道了一种无需提取的、基于银沉积的原位比色测定方法，适用于LPS的检测。该方法已被用于在不同环境条件下表征副溶血性弧菌（VP）的LPS产生情况，并通过SDS-PAGE银染色和免疫印迹进行了验证。结果显示，在银沉积后，LPS形成了棕色沉淀物，在430 nm处具有特征性的Ag吸收峰，而囊多糖或蛋白质则没有这种现象。银的吸收强度与LPS浓度（50–330 μg/mL）呈强正相关。扫描电子显微镜和透射电子显微镜证实了Ag直接沉积在游离LPS和细菌细胞表面。原位银染色结果与使用传统方法评估VP在不同环境条件下的LPS产生情况的结果一致。这种无需提取的方法有助于快速、可靠地评估细菌和LPS突变株中的LPS产生水平，为传统的基于提取的方法提供了实用的替代方案

引言

副溶血性弧菌（VP）是一种主要的致病菌，会导致海鲜污染，尤其是在贝类（例如牡蛎、蛤蜊）和甲壳类动物（例如虾、螃蟹）中，对食品安全和公共卫生构成重大威胁[1]、[2]。脂多糖（LPS）和囊多糖（CPS）作为VP的最外层物理屏障，与多种关键生物功能密切相关，包括维持外膜结构完整性、在感染期间促进免疫逃逸、作为渗透屏障、介导表面粘附和生物膜形成以及促进环境适应[3]、[4]。这些多糖在疫苗开发和免疫学检测中也具有重要意义[5]。由于其高度限制性和保护性特性，LPS和CPS会阻碍抗生素的渗透并干扰抗体对细菌表面蛋白的识别[6]、[7]。

细菌在各种环境中的LPS和CPS表达受到多种系统和环境因素的严格调控。这些调控系统包括Lpt（脂多糖转运）和ATP结合盒（ABC）转运系统，以及Wzx/Wzy依赖的途径[3]、[4]、[8]。因此，快速表征VP在不同环境条件下的LPS表达模式对于推进微生物学、免疫学、疫苗开发和内毒素检测研究至关重要[9]。

目前，用于评估LPS表达的现有方法存在显著局限性。鲎变形细胞裂解物（LAL）测定法具有极高的灵敏度（0.01 EU/mL），是量化药品和医疗器械中内毒素活性的金标准，但它主要检测游离形式的LPS，而非其结合在细胞上的形式。此外，该方法在应用过程中面临蛋白质掩盖、可持续性有限和成本相对较高的问题[10]、[11]。通过SDS-PAGE或O-抗原标准血清进行免疫印迹的LPS银染色已被广泛用于定性/半定量结构分析。然而，这种方法存在一些缺点，如需要纯化的LPS、操作繁琐且耗时[12]、[13]。基于质谱（MS）的技术，包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）MS和电喷雾离子化（ESI）MS，可以提供详细的结构信息并实现相对定量。不过，这些方法需要高度纯化的LPS，需要较高的技术专长，并依赖于昂贵的仪器[14]、[15]。

本研究旨在开发一种基于原位银沉积在细菌LPS上并随后进行比色检测的无需提取的方法。首先通过使用提取的LPS、CPS、外膜蛋白A（OmpA）和牛血清白蛋白（BSA）作为对照来验证该方法的可行性。通过优化试剂和剂量，系统地提高了LPS的检测灵敏度。随后通过测试弧菌属和金黄色葡萄球菌菌株，证明了该方法的通用性。使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察到了LPS和细菌细胞上的银沉积。最后，使用所开发的方法评估了在不同条件下培养的四种VP菌株的LPS产生水平，并通过传统的银染色和基于SDS-PAGE的免疫印迹进行了验证。

部分内容

细菌和培养条件

将VP（CICC21618、CICC21619、CICC 21528和CGMCC1.1616）、恶魔弧菌 MCCC 1A00232以及金黄色葡萄球菌 ATCC 29213的冷冻菌株接种到添加了3% NaCl的LB固体培养基中，37°C培养18小时。这些菌株作为种子溶液，以1%（V/V）的比例接种到添加了3% NaCl的LB肉汤中。接种后的肉汤在37°C下培养，直到OD₆₀₀达到0.6–0.8。在5,000 × g离心10分钟后，将细胞重新悬浮在1%

银沉积LPS的颜色变化、UV–vis光谱和形态

图1a显示，从VP中提取的LPS经过银沉积后，溶液迅速发生了比色反应。随着AgNO₃剂量的增加（0–500 μL），颜色从浅棕色逐渐变为深棕色。未经处理的LPS在200–1000 nm范围内没有显著的吸收峰，而经过处理后，在410–460 nm处出现了特征性的银吸收峰，最大吸收峰位于430 nm。

讨论

与先前的研究一致，我们的研究发现，使用电子显微镜观察时，提取的VP LPS呈现出聚集状态。这种聚集现象是因为LPS是一种两亲性分子，具有强疏水性的脂质A部分和亲水性的O-抗原，这使得LPS在水溶液中容易形成核壳聚集体[22]、[23]。先前的一项研究表明，在1 mM MgCl₂溶液中，6 mg/mL的LPS会形成多种形态

结论

我们建立了一种无需提取的分析方法，可用于快速评估细菌的相对LPS表达水平。该方法基于细菌LPS的过碘酸盐氧化和随后的原位银沉积，在弧菌物种表面形成了银纳米颗粒，并在430 nm处产生了明显的吸收峰，其强度与LPS浓度成正比。该方法的应用范围为10–330 μg/mL，LPS的检测限（LOD）为50 μg/mL。

CRediT作者贡献声明

邱俊杰：撰写初稿、数据可视化、项目管理、方法学设计、实验实施、数据整理。张晓荣：资源获取、项目管理、方法学设计。李帅：项目管理、方法学设计、数据整理。潘赛坤：监督工作、软件使用、资源协调。王文斌：撰写与编辑、结果验证、监督工作、资源协调、项目管理、资金申请、数据分析、概念构思。

作者贡献

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资金声明

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32172284）、江苏省博士后研究计划基金（项目编号：2021K316C）、连云港市博士后研究资助计划（项目编号：LYG20210001）以及江苏省海洋生物资源与环境重点实验室开放基金（项目编号：SH20201202）的支持。

未引用的参考文献

[32], [33]

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。