利用近红外光谱技术和超声辅助的酿酒酵母（S. cerevisiae）培养方法，对米酒发酵过程中的关键参数进行化学计量监测

《Microchemical Journal》：Chemometric monitoring of critical parameters in rice wine fermentation using near-infrared spectroscopy with ultrasound-assisted S. cerevisiae cultivation

近红外光谱与超声辅助培养结合实现米酒发酵关键参数实时监测，通过45kHz超声波处理酵母培养并筛选特征波长，建立协同区间偏最小二乘回归模型，对酒精强度、总糖、总酸和pH值预测的决定系数均大于0.94，均方根误差小于0.51，验证了NIR技术结合物理预处理在生物发酵过程在线监测中的高效性。

　　

Jing Hao|Mengyuan Yang|Benjamin Kumah Mintah|Chunhua Dai|Rong Zhang|Zhaoli Zhang|Haile Ma|Ronghai He

江苏大学食品与生物工程学院，中国江苏省镇江市学府路301号，212013

摘要

本研究通过将近红外（NIR）光谱技术与化学计量学相结合，实现了对米酒发酵过程中关键参数的实时监测。通过固定频率超声波辅助培养酿酒酵母（S. cerevisiae）来优化发酵过程，这种方法不仅限于传统的NIR监测，还通过特定的物理预处理主动改变了发酵系统。酿酒酵母的超声波辅助培养条件为：对数中期、28 kHz、20分钟和45 W/L。利用竞争性自适应加权采样（CARS）方法筛选特征波长后，基于协同区间偏最小二乘法得到的校正模型和预测模型的Rc、RMSEC、Rp和RMSEP分别为：酒精度0.974、0.42和0.959、0.51；总糖含量0.959、10.23和0.946、11.55；总酸含量0.948、0.25和0.939、0.28；pH值0.960、0.13和0.942、0.33。结果表明，所建立的模型具有准确性和稳定性，证明了其在利用超声波辅助培养酿酒酵母的米酒发酵过程中进行实时生物过程监测的适用性。这些发现凸显了NIR光谱技术作为一种快速、无损工具在生物技术应用中优化发酵控制的潜力。

引言

中国传统米酒（RW）的生产包括糖化和酒发酵两个阶段，主要原料为大米和其他谷物[1]。超声波是频率超过人类听觉极限（>20 kHz）的声波[2]、[3]。作为一种非热物理处理技术，超声波因设备安全可靠、机制研究较为成熟、能耗低、效率高且热效应小等优点，在食品和微生物领域得到了广泛应用[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。研究表明，超声波技术在酒发酵中的应用可以提高原料利用率，促进发酵过程，增强代谢活性，从而缩短发酵周期、提高酒精产量并丰富酒的风味化合物[18]、[19]、[20]。Xing等人发现，低强度超声波处理可以增强微生物的代谢活性并促进细胞生长，发酵时间从56小时缩短至48小时（处理条件为10分钟、0.167 W/cm2、间隔8小时）[21]。Zheng等人发现，在45 kHz、360 W、15°C和30分钟的超声波处理后，酒中检测到三种新的酯类（乙基壬酸酯、异戊基乙酸酯和乙基异戊酸酯），总酯含量也比未经过超声波处理的酒增加了24.59%[22]。

随着超声波技术在酒发酵领域的应用，人们对酒质的要求也越来越高，而传统米酒容易出现质量不稳定[23]和批次间质量差异较大[24]的问题。准确控制发酵过程对于实现米酒的最佳质量和产量至关重要[25]。尽管传统的分析和检测方法可以在米酒发酵过程中提供酒精含量、总糖和总酸等关键指标的定量数据，但这些方法通常耗时较长、操作复杂且工作量大，可能导致无法及时监测其变化[26]。因此，随着发酵技术的发展和对质量控制需求的增加，能够快速准确地在线监测产品质量变得尤为重要。

位于可见光和中红外光之间的电磁波被称为近红外（NIR）光，其光谱范围为780–2526 nm[27]。NIR光谱技术是通过分子振动产生的吸收光谱。研究表明，NIR光谱技术具有速度快、方便快捷和环保等优点[28]、[29]、[30]、[31]。将其与化学计量学结合已被证明是实时监测发酵过程参数的有效方法[32]。Buratti等人证明，无损NIR方法适用于监测酒发酵过程，能够提供与化学参数一致的产品质量关键信息，乙醇、甘油和葡萄糖的相关系数分别为0.96、0.91和0.92[33]。Di Egidio等人基于NIR光谱技术建立了校准良好的模型，可用于在线评估红葡萄酒中的酒精发酵过程，特别是预测葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的变化，校正后的均方根误差分别为1.32、5.19、2.04和0.44 g/L[34]。Ye等人使用FT-NIR光谱技术研究了42个苹果酒样品中的挥发性化合物，发现酯类的预测能力平均R²值为0.90，其中乙基乙酸酯的预测能力最强（0.92）；醇类的预测能力平均R²值为0.92，其中己醇的预测能力最强（0.95）[35]。

对于超声波辅助的米酒发酵，酒精度、总糖含量、总酸含量和pH值是判断发酵米酒质量的关键指标。本文在利用NIR光谱技术进行发酵监测的基础上，进一步将该分析技术与特定的过程优化策略（固定频率超声波辅助酵母培养）相结合。因此，本文旨在建立一种实时监测模型，用于在这种物理-生物预处理条件下米酒发酵过程中关键指标（酒精度、总糖、总酸和pH值）的监测。

材料

抛光圆粒大米由丹阳佳禾米业有限公司（中国江苏）提供。α-淀粉酶和糖化酶购自上海源业生物技术有限公司（中国）。其他所有试剂均为分析级，购自中国药科大学化工有限公司（上海）。

酵母菌株及培养条件

本研究使用的S. cerevisiae 1048菌株来自中国工业微生物菌种保藏中心（北京）。该菌株接种在酵母蛋白胨葡萄糖培养基上

米酒发酵过程中指标的变化

图2(a)至(d)分别展示了在超声波辅助培养酿酒酵母过程中酒精度、总糖含量、总酸含量和pH值的变化。如图2(a)所示，米酒发酵过程中的酒精度总体呈上升趋势。在发酵初期，底物中含有丰富的糖分，这些糖分是在糖化过程中产生的

结论

本研究建立了在线监测模型，用于在固定频率超声波辅助培养酿酒酵母（S. cerevisiae）过程中关键参数的变化。通过将NIR光谱技术与化学计量学结合这种物理预处理方法，本研究为通过物理手段主动改性的发酵系统提供了实时监测的潜在框架。

CRediT作者贡献声明

Jing Hao：撰写——初稿、方法论、研究、概念构建。Mengyuan Yang：方法论、研究、概念构建。Benjamin Kumah Mintah：撰写——审稿与编辑、方法论。Chunhua Dai：方法论、研究。Rong Zhang：方法论、研究。Zhaoli Zhang：方法论、研究。Haile Ma：验证、数据分析。Ronghai He：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号31972208）、江苏省重点研发计划（编号BE2020329、BE2021348）的资助，同时也得到了江苏省高等教育机构优先学术发展计划（PAPD）项目的支持。