《Molecular and Cellular Neuroscience》：4-MEC potentially triggers CAV1
via the BDNF-TrkB signaling pathway
编辑推荐：
Caveolin-1 (CAV1) mediates 4-MEC-induced neuroplasticity via BDNF-TrkB signaling in vitro and vivo.中文摘要：
张王平|曹芳琪|李明|范哲宇|吴丽人|刘文斌|史平
华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237，中国
摘要
4-甲乙基卡西酮（4-MEC）是一种具有精神刺激作用的合成卡西酮类药物，越来越多地被滥用为“设计药物”。然而，其分子机制，尤其是与神经可塑性调节相关的机制，仍知之甚少。Caveolin-1（CAV1）是一种膜脂筏的支架蛋白，已被证实可以组织多种突触信号蛋白来调节突触信号传导和神经可塑性。在本研究中，我们探讨了CAV1是否调节4-MEC在人类SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和小鼠条件性位置偏好（CPP）模型中引起的BDNF-TrkB信号通路及神经可塑性标志物的变化。通过qRT-PCR和Western blotting实验，我们发现4-MEC显著上调了CAV1的mRNA和蛋白质水平，以及BDNF-TrkB信号通路成分和神经可塑性标志物（GAP43、MAP2、SYP）的水平。siRNA介导的CAV1敲低实验消除了4-MEC引起的这些蛋白质和神经可塑性相关mRNA的增加，而CAV1过表达则增强了这些效应。此外，分子对接预测了4-MEC与CAV1之间的潜在结合位点；蛋白质对接还预测了CAV1与TrkB之间的潜在结合位点，共免疫沉淀实验确认了它们在SH-SY5Y细胞中的物理相互作用。在CPP实验中暴露于4-MEC的小鼠中，我们也观察到了类似的CAV1、BDNF-TrkB信号通路成分和神经可塑性标志物的上调。这些发现表明CAV1可能是4-MEC通过BDNF-TrkB信号通路调节神经可塑性的关键介质。这为合成卡西酮的毒性研究提供了一个新的分子靶点，对法医研究具有潜在意义。
引言
新型精神活性物质（NPS）的非医疗用途，俗称“设计药物”或“合法兴奋剂”，已成为全球公共卫生危机，仅在欧洲联盟每年就发现超过100种新化合物（Luethi和Liechti，2020；Peacock等人，2019）。其中，合成卡西酮——安非他明的β-酮类类似物——是仅次于合成大麻素的第二大NPS类别，占与新型兴奋剂相关的急诊科就诊病例的31%（Van Hout，2017；Valente等人，2014）。这类物质于21世纪00年代末首次进入娱乐市场，像4-甲氧基麻黄酮（4-MMC）和4-甲乙基卡西酮（4-MEC）这样的衍生物模仿了来自卡西酮的兴奋效应，但具有更强的脂溶性和血脑屏障穿透性，从而增加了成瘾潜力（Macrì等人，2013；Smith等人，2016）。
2010-2011年波兰及其他地区禁止4-甲氧基麻黄酮后，4-MEC迅速成为主要替代品，到2012年在新西兰查获的“摇头丸”样本中占42%，在波兰法医研究所检测出的NPS阳性病例中占58%（Saha等人，2015；Alvarez等人，2017）。虽然4-MEC与4-甲氧基麻黄酮在结构上具有同源性（图1），但其较弱的欣快效应和较短的作用半衰期（1.8小时对比4.2小时）导致了补偿性过量使用模式，尤其是在之前对4-甲氧基麻黄酮有耐受性的使用者中（Gatch等人，2015；Duart-Castells等人，2021）。这种药代动力学特征与神经毒性风险增加相关，有病例报告指出，在超过300毫克的剂量下会出现5-羟色胺综合征和纹状体多巴胺耗竭（Luethi和Liechti，2020；Macrì等人，2013）。英国检测到的4-MEC病例数量也在增加（尸检案例）。在2010-2012年的三年间，4-MEC成为英国检测到的第二常见的卡西酮类物质（Elliott和Evans，2014）。波兰的情况也是如此，那里“合法兴奋剂”制品的检测数量也有所增加（Gil等人，2013）。英国于2010年对4-MEC实施了管制（WHO药物依赖专家委员会：第三十六份报告，2014）。研究表明，大多数4-MEC使用者为30至45岁的男性，并且有使用新型精神活性物质的历史（Van Hout，2014）。
当前的神经毒理学模型认为合成卡西酮主要通过单胺转运体抑制发挥作用（Rickli等人，2015）。然而，新的法医证据表明这些物质可能劫持神经营养信号级联反应，引发持续的突触重塑——这是物质使用障碍的标志（Most等人，2014）。
然而，对于4-MEC的分子机制，尤其是其与神经可塑性调节因子的相互作用，仍存在关键空白。值得注意的是，Caveolin-1（CAV1）作为一种膜脂筏（MLR）的支架蛋白，已被证明可以组织GPCRs和多种突触信号蛋白（例如，原肌球蛋白受体激酶（Trk）来调节突触信号传导和神经可塑性（Huang等人，2022）。Cui及其团队（Cui等人，2018）发现海马区的CAV1在吗啡成瘾行为背后的神经可塑性变化中起着关键作用。Wang及其团队（Wang等人，2021）发现体外吗啡处理显著提高了CAV1的表达，并导致神经可塑性变化，长期吗啡暴露可显著增加海马区微管相关蛋白2（MAP2）阳性的神经元树突生长。
人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系是目前最常用的体外神经毒性研究模型（Xie等人，2010）。这种未分化的SH-SY5Y细胞系缺乏极化现象，也不表达成熟的神经元标志物。它增殖迅速，并表达未成熟神经元、胶质细胞及其前体的标志物（Kovalevich等人，2021）。由于这些特性，它更适合用于研究神经元前体细胞而非成熟神经元，可以用来评估各种化合物对神经系统的潜在神经毒性效应并阐明其毒性机制（?ahin等人，2021）。通过人工诱导，SH-SY5Y细胞可以进一步分化为类神经元细胞。此外，所使用的分化剂可以影响分化细胞的神经递质谱型（Vulin等人，2025）。这些分化细胞可用于研究相关化合物对不同功能神经细胞的毒性。
在本研究中，我们采用了一种综合方法来填补这一空白，该方法结合了4-MEC对未分化SH-SY5Y神经元中CAV1/BDNF-TrkB表达的剂量-反应分析，并通过基因操作（敲低/过表达）来确定CAV1的调节作用。随后，我们利用分子对接和共免疫沉淀实验验证了4-MEC、CAV1和TrkB之间的相互作用。此外，我们还使用标准化的条件性位置偏好（CPP）范式进行了行为相关性分析。这种多层次分析表明，4-MEC通过潜在地直接结合CAV1的支架结构域，协调上调了CAV1和TrkB的磷酸化，从而表明CAV1可能是4-MEC诱导的神经适应的潜在介质。在我们的研究中，我们进一步探讨了其潜在的分子机制，并发现CAV1通过BDNF-TrkB信号通路在4-MEC诱导的神经适应中发挥作用。重要的是，我们强调了这些关系的关联性而非因果性，这突显了需要进行体内操作CAV1以建立功能联系的必要性。
部分摘录
细胞培养和试剂
SH-SY5Y细胞系购自American Type Culture Collection。SH-SY5Y细胞在含有10% FBS（PANBiotech，Aidenbach，德国）和1%青霉素-链霉素（10,000 μg/mL青霉素和10 mg/mL链霉素；Solarbio Life Science，北京，中国）的DMEM（Gibco/Invitrogen，Camarillo，美国）培养基中生长。使用0.05% trypsin-EDTA（Amersco，纽约，美国）进行1分钟胰蛋白酶处理后，细胞在潮湿培养箱（37°C，5% CO2）中培养备用。
4-MEC和
4-MEC对CAV1、BDNF-TrkB相关信号通路分子及神经可塑性标志物表达的影响
使用细胞计数试剂盒8评估了4-MEC对人类SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞存活率的影响。结果显示，150 μmol/L的4-MEC在24小时和48小时内并未显著影响细胞存活率，而300和600 μM的4-MEC则表现出明显的时效依赖性抑制作用（图2A）。值得注意的是，150 μmol/L的4-MEC在48小时后显著提高了CAV1的水平（通过Western blotting确定，图2B）。鉴于CAV1可以被4-MEC诱导，
讨论
在本研究中，我们首先发现4-MEC在未分化的SH-SY5Y细胞中表现出潜在的时效依赖性细胞存活抑制作用。我们选择了安全的浓度（150 μmol/L的4-MEC）和孵育时间（48小时）作为后续处理。数据显示，4-MEC显著提高了CAV1的水平，激活了BDNF-TrkB信号通路，并上调了神经可塑性标志物（GAP43、MAP2和SYP）的mRNA水平。然后，通过分子对接实验，我们发现4-MEC
结论
在本研究中，我们首次发现CAV1通过调节BDNF-TrkB信号通路与4-MEC的作用相关，从而增加了SH-SY5Y细胞中神经可塑性标志物的mRNA水平。同时，体内研究证实了4-MEC在CPP模型中暴露于4-MEC的小鼠中对成瘾相关信号通路的影响。因此，CAV1成为4-MEC暴露过程中的一个关键靶点，发挥着潜在且重要的作用
作者贡献声明
张王平：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、数据分析、数据整理。曹芳琪：资源获取、方法学、研究。李明：方法学。范哲宇：验证。吴丽人：数据整理。刘文斌：资金获取。史平：撰写——审稿与编辑、方法学。
致谢
本工作得到了上海犯罪现场证据重点实验室（2024XCWZK07）启动项目的资助。
