新型麻醉药泛醌-5对小鼠心脏传导的影响及其可靶向性机制探究

《The FASEB Journal》：Targetable Effects of the Anesthetic, Ubiquinone-5, on Murine Cardiac Rhythm

这项研究表明，新型静脉麻醉药泛醌-5(Ub5)在临床相关高剂量下可诱发心脏二度房室传导阻滞，其机制涉及通过天冬氨酸-谷氨酸载体(Aralar)诱导线粒体质子漏增加和抑制电子传递链，导致心肌细胞线粒体膜电位(ΔΨm)受损。研究通过体内、体外及分子层面实验证实，药理学抑制Aralar能够挽救Ub5引起的心律失常，揭示了Ub5心脏毒性的特异性作用靶点，为未来开发心脏副作用可控的新型麻醉药提供了重要线索和思路。

　　

1 引言

全身麻醉药虽然主要作用于中枢神经系统，但对心脏也可能产生“脱靶”效应，影响心律、电传导和心肌收缩力。这类副作用具有药物特异性和剂量依赖性。例如，目前最广泛使用的静脉镇静催眠药丙泊酚(propofol)在临床相关剂量下会损害心室收缩，偶尔在急性给药后引起心律失常和房室(AV)传导阻滞。此外，长期持续大剂量使用丙泊酚可诱发危重患者出现心动过缓、心脏传导异常和心肌衰竭。这种危及生命的心脏毒性被认为是丙泊酚输注综合征的表现，尤其在婴幼儿中。

丙泊酚被认为是通过干扰心肌细胞线粒体产生和维持线粒体膜电位(ΔΨ_m)的能力来诱发明显的心脏毒性。最近研究发现，辅酶Q类似物泛醌-5(ubiquinone-5， Ub5)在线粒体内表现出相似的生物学活性，并在静脉注射时具有麻醉作用。与丙泊酚类似，超治疗剂量的Ub5会引起离体灌注的新生小鼠心脏可逆性心动过缓和完全性心脏传导阻滞。然而，临床相关剂量Ub5的心脏效应尚未得到评估。因此，本研究旨在确定治疗剂量的Ub5如何影响心脏节律，假设Ub5会干扰心脏传导。我们通过体内（成年小鼠）、体外（离体灌注小鼠心脏）及分子层面（离体心肌细胞线粒体）实验验证了这一假设，并试图阐明Ub5诱导心脏毒性的机制。

2 材料与方法

本研究遵循美国国立卫生研究院、哥伦比亚大学欧文医学中心实验动物管理与使用委员会(IACUC)以及ARRIVE指南，符合《动物福利法》和实验动物评估与认证协会(AAALAC)的规定。实验方案获得了哥伦比亚大学欧文医学中心IACUC的批准。

研究使用了6-12周龄的C57BL/6雄性小鼠。同时，还使用了在SVJ129 × C57BL/6背景上具有Aralar(Slc25a12)基因杂合突变的小鼠，通过交配产生Aralar敲除(KO)小鼠和野生型(WT)同窝对照。基因型通过标准PCR确定。Aralar^?/?和Aralar^+/+雄性小鼠在出生后第10天进行研究。

小鼠通过尾静脉随机注射单次剂量的Ub5或等体积的脂质乳剂（媒介物对照），同时使用针状电极持续监测和记录心电图(ECG)、心率和心律。对于离体心脏实验，小鼠麻醉后取出心脏，进行主动脉插管，开始恒流逆行灌注。在稳定后，通过表面电极记录ECG，并持续记录心率和心律。随后，心脏暴露于Ub5或等体积的脂质乳剂。在挽救实验中，心脏持续暴露于Ub5，随后连续共同施用Aralar抑制剂吡哆醛5'-磷酸(PLP)。还进行了PLP单独施用的对照实验。

通过差速离心法分离心脏心室线粒体。使用Clark型电极和四苯基鏻(TPP⁺)离子选择电极，在质子漏呼吸期间同时测量离体心肌细胞线粒体的氧耗和ΔΨ_m。还在不同实验中添加了PLP以非特异性抑制Aralar。使用分光光度法测量离体心脏线粒体中抑制剂敏感的电子传递链(ETC)酶复合体稳态活性。

3 结果

4.1 泛醌-5诱导1型二度房室传导阻滞

为确定临床相关剂量的Ub5如何在体内影响心脏节律，我们首先评估了年轻成年小鼠尾静脉注射Ub5后的心电图。我们评估了3种不同剂量的Ub5以及脂质乳剂对照。Ub5剂量分别为亚治疗剂量(50 mg/kg)、治疗剂量(100 mg/kg)和已知能导致100%动物翻正反射消失的相对高剂量(200 mg/kg)。脂质乳剂、50 mg/kg Ub5或100 mg/kg Ub5对任何注射小鼠的心脏节律均未产生可检测的影响。然而，200 mg/kg Ub5在注射后不久即诱导出二度房室传导阻滞。对P-R间期的检查显示，在出现房室传导缺陷之前，P-R间期逐渐延长，表明是文氏或莫氏1型传导阻滞。同样的节律紊乱在暴露于200 mg Ub5/kg心脏重量的离体灌注年轻成年心脏中也观察到了，这表明这是一种直接的药物效应。因此，临床相关的高剂量Ub5干扰了心脏传导。值得注意的是，Ub5暴露心脏的灌注压似乎略有下降，表明存在一定程度的冠状动脉血管舒张。然而，我们没有在注射后的小鼠体内测量血压；因此，尚不清楚低灌注是否促进了心律失常的发生。

4.2 泛醌-5在心肌细胞线粒体中诱导过度的质子漏

接下来，我们在体外将离体心肌细胞线粒体暴露于Ub5或等体积的脂质乳剂，以确定心脏毒性的机制贡献者。我们首先通过量化和比较氧耗率和ΔΨ_m相对于基线的变化来评估对质子漏的影响。脂质乳剂对呼吸速率和ΔΨ_m的影响很小。另一方面，Ub5导致漏呼吸显著增加，ΔΨ_m从基线急剧且显著下降。Ub5诱导的氧耗速率和ΔΨ_m变化显著大于脂质乳剂诱导的变化。因此，Ub5部分由于在离体心肌细胞线粒体中引发未代偿的质子漏增加而损害了ΔΨ_m。

4.3 泛醌-5在辅酶Q水平抑制电子传递

接下来，我们测量了暴露于Ub5或等体积脂质乳剂的离体线粒体中每个电子传递链(ETC)酶复合体在暴露期间的动力学活性，以确定Ub5干扰ΔΨ_m生成能力的作用点。与未暴露的对照相比，脂质乳剂显著抑制了复合体I、复合体I+III和复合体V的稳态活性。然而，鉴于脂质暴露的线粒体仍能产生足够的ΔΨ_m，这些效应在功能上并不显著。Ub5相对于未暴露或脂质暴露的对照（取决于浓度）刺激了复合体I、II和III的活性，同时抑制了复合体V。Ub5对复合体V的效应与脂质效应无显著差异。另一方面，与脂质暴露的线粒体相比，Ub5显著降低了复合体I+III的稳态连接活性，并且相对于未暴露的对照，显著降低了复合体II+III的活性。因此，Ub5诱导的主要扰动是在辅酶Q水平抑制了ETC。总之，数据表明Ub5通过诱导线粒体未代偿的质子漏和在辅酶Q水平抑制ETC，干扰了心肌细胞线粒体产生和维持足够ΔΨ_m的能力。

4.4 Aralar是Ub5诱导质子漏的来源且可被靶向

接下来，我们旨在确定天冬氨酸-谷氨酸载体Aralar在Ub5诱导的心肌细胞线粒体质子漏中的作用，因为之前的研究已将其确定为前脑线粒体中的一个功能靶点。通过药理学阻断和基因沉默，我们评估了暴露于Ub5和脂质的线粒体在漏呼吸期间氧耗速率和ΔΨ_m的变化。非特异性Aralar抑制剂PLP在Ub5暴露的线粒体中导致漏呼吸显著减少，同时ΔΨ_m缓慢而稳定地上升。相比之下，PLP在脂质暴露的线粒体中导致漏呼吸速率和ΔΨ_m均显著下降，表明PLP介导了ETC抑制。在单独的实验中，我们证实PLP确实会抑制ETC，从而损害未处理线粒体的ΔΨ_m。PLP后氧耗和ΔΨ_m的变化在脂质和Ub5暴露的线粒体之间存在显著差异。重要的是，漏呼吸的显著减少与PLP后ΔΨ_m相对积极的变化相结合，表明Ub5暴露的线粒体中一个主要的质子漏来源被阻断。

鉴于PLP是一种非特异性Aralar抑制剂，我们接下来确定了基因沉默Aralar对离体心肌细胞线粒体中Ub5诱导的质子漏的影响。Ub5在Aralar^?/?和野生型同窝对照线粒体中都引起了ΔΨ_m的显著下降，两组间ΔΨ_m的变化无显著差异。然而，Ub5未能诱导Aralar^?/?线粒体发生漏，反而导致氧耗速率下降。重要的是，缺乏Aralar的线粒体呼吸速率变化与野生型对照存在显著差异。氧耗速率的伴随下降以及ΔΨ_m的下降表明Ub5介导了Aralar突变体线粒体的ETC抑制；这一过程在缺乏过度质子漏的情况下被揭示出来。这些发现表明Aralar是Ub5诱导质子漏的主要来源。

接下来，我们旨在确定Aralar在Ub5诱导的二度房室传导阻滞中的作用。在先前的工作中，我们发现Aralar^?/?新生心脏对Ub5的心脏节律毒性作用相对抵抗。不幸的是，Aralar^?/?小鼠存活时间不超过几周。因此，我们选择在离体灌注的年轻成年野生型小鼠心脏中使用PLP进行药理学阻断来靶向Aralar。我们评估了PLP在持续输注期间对Ub5诱导的节律紊乱的影响，使用脂质乳剂作为载体对照。虽然在离体灌注的脂质乳剂暴露心脏中没有观察到心脏节律的变化，但我们观察到在开始施用PLP后不久心率下降。在单独的实验中，我们确定PLP暴露会减慢未处理心脏的自发心率。这种变时效应可能与PLP介导的ETC抑制有关，但也可能存在其他机制。与我们最初的实验一致，我们发现Ub5在离体灌注心脏中迅速诱导了二度房室传导阻滞。在房室传导阻滞发生后，将心脏暴露于PLP可在几分钟内使心律恢复为窦性心律，尽管速率比基线慢。PLP能够将离体灌注心脏从Ub5介导的节律紊乱中挽救出来，这表明Aralar在Ub5诱导的心脏毒性中发挥了功能性作用。

5 讨论

麻醉药因其镇静催眠特性在临床实践中常用，但许多药物会以剂量依赖性的方式对心脏产生不良影响。在此，我们发现临床相关高剂量的麻醉药Ub5在年轻成年小鼠心脏中（包括体内和体外）诱发了1型二度房室传导阻滞。已知有多种药物可诱发此类心律失常，静脉麻醉药丙泊酚的使用也与莫氏1型房室传导阻滞有关。丙泊酚以浓度依赖的方式抑制房室结传导，并延长文氏周期长度和有效不应期。这些负性传导作用被认为是通过直接激活毒蕈碱M₂受体介导的。然而，丙泊酚和Ub5在中枢神经系统的作用机制不同，因此可能不共享引发心律失常的心脏分子靶点。

我们先前发现天冬氨酸-谷氨酸载体Aralar是Ub5的药理学麻醉靶点，也是前脑线粒体中未代偿质子漏的来源。Aralar的激活被证明是Ub5介导麻醉反应的重要机制贡献者。然而，这种机制是Ub5特有的，因为丙泊酚对Aralar没有功能性影响。在心脏中，基因沉默Aralar使得离体灌注的新生小鼠心脏对Ub5的毒性剂量相对抵抗，但对丙泊酚不抵抗。因此，Ub5和丙泊酚可能通过不同的机制诱发心律失常。在当前工作中，我们发现Ub5通过抑制辅酶Q水平的电子传递和通过Aralar诱导过度质子漏，损害了离体心肌细胞线粒体的ΔΨ_m。药理学抑制Aralar挽救了离体灌注的年轻成年心脏的节律紊乱，表明Aralar介导的质子漏在Ub5诱发的心律失常中发挥了功能性作用。因此，鉴于Ub5诱导意识丧失的已知机制，Ub5对小鼠心脏的不良效应是“靶向性”的。

ΔΨ_m是线粒体质子动势的主要组成部分，是有氧三磷酸腺苷(ATP)合成所必需的。线粒体产生或维持ΔΨ_m能力的缺陷会限制高能磷酸盐的产生，并危及细胞稳态。在心脏中，大部分ATP用于支持收缩和舒张，生物能量能力受损可导致心力衰竭。然而，导致氧化磷酸化受损的线粒体缺陷也可能导致节律紊乱。例如，Kearns-Sayre综合征患者可发展为完全性心脏传导阻滞，Leigh综合征患者可发展为心律失常和传导缺陷。

从Leigh综合征模型小鼠(Ndufs4^?/?)中可以窥见线粒体功能受损与心律失常之间的机制联系。携带全局Ndufs4^?/?敲除突变的小鼠存在复合体I缺陷、ΔΨ_m受损以及NADH/NAD⁺比率升高。NADH/NAD⁺的改变导致心脏钠通道Na_V1.5的高乙酰化，从而减少钠电流并导致缓慢性心律失常、二度房室传导阻滞，偶尔出现完全性心脏传导阻滞。尽管本研究未评估Na_V1.5乙酰化，但这种机制可能是ΔΨ_m受损与心律失常之间的连接点，并可解释Ub5如何诱发二度房室传导阻滞。

我们认识到当前研究存在一些局限性。例如，我们没有确定Ub5对心脏其他方面功能（如收缩力或舒张功能）的影响。因此，未来工作需要评估这些过程，并探索Ub5在更大动物模型中的心脏效应。我们也承认我们对传导性的评估是粗略的，仅涉及观察Ub5暴露期间P-R间期的变化。因此，我们计划在后续研究中使用更深入的实验方法来量化房室结传导。此外，我们认识到有必要阐明Ub5诱导房室传导阻滞的确切机制（例如毒蕈碱M₂受体或Na_V1.5乙酰化的作用），这些机制位于ΔΨ_m效应的下游。最后，我们没有正式评估Ub5对冠状动脉灌注的影响。由于低灌注可能导致心律失常的发生，未来工作中需要对此进行评估。

尽管存在这些局限性，我们的发现具有重要意义。首先，这项工作表明，与其他麻醉药一样，Ub5具有心脏副作用，可诱发心律失常。其次，Ub5诱导心脏毒性的一个上游贡献机制（即Aralar激活）似乎是可靶向的。后一特性将Ub5与其他镇静催眠药区分开来，并对未来的药物开发具有启示意义。因此，在心脏中药理学抑制Aralar成为一种尝试预防Ub5介导心律失常的临床相关策略。这种方法的成功和可行性可能使Ub5作为一种麻醉药更安全，心脏副作用有限。然而，若无法在体内阻断心脏的Aralar，可能成为无法逾越的障碍，阻碍Ub5作为可行镇静催眠药的进一步开发。无论未来工作的结果如何，该领域都应致力于开发具有可预防心脏副作用和有限心脏毒性的新型麻醉剂。发现此类新型镇静催眠药将具有创新性，并能推动麻醉学学科向前发展，提高安全性和有效性。