利用原始生殖细胞介导的嵌合鸡技术培育对禽白血病病毒A、B、D、E、K亚型具抗性的种系

《Poultry Science》：Generation of chimeric chickens resistant to infection by avian leukemia virus subgroups A, B, D, E, and K through primordial germ cells

禽白血病病毒(ALVs)严重威胁全球家禽健康并造成巨大经济损失。为解决此难题，本研究通过利用天然抗性基因r2和r3，成功建立了基于原始生殖细胞(PGCs)的种系嵌合技术。研究人员从清远麻鸡中分离携带抗性基因的PGCs，将其显微注射至湛江黄鸡受体胚胎，培育出具有ALV多重抗性的嵌合鸡。该研究为快速建立抗ALV家禽种群提供了高效策略，在疾病抗性育种领域具有重要意义。

　　

在养禽业的繁荣背后，一个看不见的敌人——禽白血病病毒(ALVs)——正持续威胁着鸡群健康。作为一种致癌性反转录病毒，ALV不仅会诱发免疫抑制，还能导致多种肿瘤，每年在全球范围内给家禽业造成重大经济损失。更棘手的是，该病毒已被分化为A、B、C、D、E、J、K等多个亚型，不同亚型利用不同的细胞受体入侵，使得防控工作异常复杂。传统的疫苗接种和生物安全措施虽有一定效果，但无法从根源上解决问题。于是，科学家们将目光投向了遗传学，希望从基因层面赋予鸡群“与生俱来”的抗病能力。幸运的是，自然界的基因库中已存在宝藏：在一些品系的鸡中，发现了能够抵抗特定ALV亚型感染的天然抗性等位基因，例如可抵抗ALV-A和ALV-K的^r2基因，以及可抵抗ALV-B、-D、-E的^r3基因。如何高效、快速地将这些珍贵的抗性基因导入到易感但具有优良经济性状的商业鸡种中，成为了育种学家们面临的关键挑战。这项发表于《Poultry Science》的研究，正是为了破解这一难题而展开的。

研究人员采用了原始生殖细胞(PGCs)介导的种系嵌合技术作为核心策略。该研究首先对清远麻鸡(QYPCs)和湛江黄鸡(ZJYCs)群体进行了^r2和^r3抗性位点的基因分型。通过选择性交配，他们获得了纯合抗性(^r2/r2和^r3/r3)的QYPC胚胎作为PGC供体，以及纯合易感(^s/s和^s/s)的ZJYC胚胎作为受体。从抗性供体胚胎中成功分离并体外培养了PGCs，并通过一系列分子和形态学手段进行了鉴定。随后，将培养的供体PGCs显微注射到经白消安处理以去除内源性PGCs的受体胚胎中，最终培育出可存活的嵌合鸡，并通过基因分型验证了抗性基因的成功整合与种系传递。

研究结果：

1. Genotyping of the tva^r2and tvb^r3Resistant Loci in QYPCs and ZJYCs

研究人员对QYPCs和ZJYCs进行了基因分型，在QYPCs中鉴定出同时携带纯合^r2/r2和^r3/r3基因型的个体，并将其选为PGC供体亲本。而在ZJYCs中，则筛选出纯合易感(^s/s和^s/s)的个体作为受体亲本，为后续实验奠定了基础。

2. Isolation and Culture of Donor PGCs

从纯合抗性的7日龄QYPC胚胎中成功分离出PGCs，并将其与STO饲养层细胞共培养。经过21天的培养，PGCs数量显著扩增，形成了以悬浮单细胞为主的稳定细胞系，细胞总数达到约1×10⁶，表明成功建立了来自抗性鸡的PGC细胞系。

3. Characterization of the Donor PGCs

对培养的PGCs进行了一系列表征。碱性磷酸酶染色呈阳性，糖原(PAS)染色显示细胞含有黏蛋白和糖蛋白。RT-PCR检测证实PGCs特异性表达生殖细胞相关基因DDX4、c-Kit和PRDM14。扫描电镜观察显示PGCs细胞呈球形，表面覆盖有相互交织的微绒毛，这些特征均证实了所培养细胞的PGCs身份。

4. The generation of chimeric chickens with tva^r2/r2and tvb^r3/r3genotypes

将体外培养的供体PGCs（每胚胎约1000个细胞）通过心脏显微注射的方式导入经白消安预处理的3日龄受体ZJYC胚胎中。在注射的153枚胚胎中，有62只雏鸡成功孵化。对孵化后的嵌合公鸡进行基因分型分析，在2周龄公鸡的睾丸组织以及20周龄公鸡的精液中，均检测到了供体来源的^r2/r2和^r3/r3抗性基因型。最终，种系传递效率达到35.7%，证明抗性供体PGCs成功整合到了受体鸡的生殖系中，并能够通过配子传递给后代。

结论与意义：

本研究成功地利用PGCs介导的种系嵌合技术，将清远麻鸡中天然存在的ALV多重抗性基因(^r2和^r3)导入了易感的湛江黄鸡的生殖系中，培育出了可遗传这些抗性性状的嵌合鸡。这项工作不仅验证了PGCs技术作为一种高效、可行的生物技术工具，用于快速将优良性状（特别是天然疾病抗性）导入商业家禽品种的潜力，更重要的是，它提供了一条不依赖于传统杂交（可能受生殖隔离限制）的性状渗入新途径。该策略巧妙地绕过了不同禽类物种间可能存在的杂交障碍，为保护家禽遗传资源和实现精准育种提供了强大的技术储备。研究人员在讨论中指出，本研究培育的抗性鸡可有效抵御ALV-A、B、D、E、K五个亚型。若将此PGCs技术与CRISPR/Cas9等精准基因组编辑工具相结合，靶向编辑ALV-J的受体基因，则有望开发出能抵抗所有主要ALV亚型的“全能型”抗病鸡种，从而彻底填补禽白血病抗性育种领域的最后一块拼图。因此，这项研究标志着在家禽遗传抗病育种领域迈出了关键一步，为应对ALV这一全球性养殖业威胁提供了具有广阔前景的解决方案。