Icariin 调节绝经后骨质疏松症中骨髓间充质干细胞的成骨/成脂分化过程，这一机制可能通过 AMPK-mTOR-自噬途径实现

《Toxicology and Applied Pharmacology》：Icariin regulates osteogenic/adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in postmenopausal osteoporosis, potentially via the AMPK-mTOR-autophagy pathway

本研究通过建立绝经后骨质疏松（PMOP）小鼠模型，评估黄精素（Ica）对骨代谢及骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨/脂肪分化的影响，并揭示其通过AMPK-mTOR自噬通路的作用机制。

　　

曾玉清|王海涛|胡静涛|阮伟伟|姚志成|姜斌峰|邓舒

浙江省同德医院骨科，中国杭州310012

摘要

背景

绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种由于雌激素缺乏引起的骨骼疾病。本研究探讨了淫羊藿素（Ica）对PMOP的影响。

方法

通过双侧卵巢切除术建立卵巢切除（OVX）小鼠模型，随后给予Ica处理。使用微计算机断层扫描（micro CT）测量骨骼参数。通过苏木精-伊红染色评估脂肪含量。通过碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）、茜素红S（Alizarin Red S）和油红O（Oil Red O）染色分析小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨/成脂分化情况。逆转录-定量聚合酶链反应（reverse transcription–quantitative polymerase chain reaction）用于检测骨骼和脂质标志基因的表达。进行转录组测序（transcriptome sequencing）和细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8）检测，免疫组化和Western blot检测AMPK-mTOR-自噬通路蛋白以及骨骼和脂质标志蛋白的表达。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和AMPK抑制剂dorsomorphin验证自噬和AMPK在Ica治疗PMOP中的作用。

结果

Ica处理以剂量依赖的方式增加了OVX小鼠的骨量并减少了脂肪含量。Ica促进了OVX小鼠骨髓间充质干细胞的成骨作用并抑制了其成脂分化。转录组测序显示自噬和mTOR通路参与了PMOP。Ica降低了OVX小鼠及其骨髓间充质干细胞的mTOR和p62表达，并增加了LC3表达，而3-MA逆转了这一现象。OVX小鼠及其骨髓间充质干细胞的AMPK通路被下调，但在Ica处理后得到激活。dorsomorphin的应用改变了Ica处理后骨髓间充质干细胞中AMPK-mTOR-自噬通路的表达。

结论

Ica通过调节骨髓间充质干细胞的成骨/成脂分化来缓解PMOP，这可能涉及AMPK-mTOR-自噬通路。

引言

绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种与骨量减少和微观结构变化相关的代谢性骨骼疾病，从而增加了骨折的风险（Tenger等人，2024年）。PMOP的病理过程涉及由于内源性雌激素缺乏导致的破骨细胞分化和激活，这加速了骨吸收并导致骨丢失（Walker和Shane，2023年）。大约40%的绝经后妇女会经历骨质疏松性骨折（S?zen等人，2017年）。目前用于PMOP治疗的药物主要包括雌激素、降钙素和选择性雌激素受体调节剂（Brent，2023年）。然而，这些药物仅抑制骨吸收而不促进骨形成，效果有限且可能伴有胃肠道相关副作用。因此，寻找有效的PMOP治疗药物至关重要。

骨稳态通过严格调控来维持，以确保破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成之间的适当平衡（Raisz，2005年）。作为多能干细胞，骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的潜力，并与骨稳态密切相关（Zhang等人，2024a；Pan等人，2025年）。在骨质疏松症中，微环境的变化会损害BMSCs的增殖和成骨分化，导致成骨作用和成脂作用失衡，进而破坏骨稳态（Zhang等人，2021年；Zhang等人，2025年）。例如，表观遗传学抑制Wnt通路会抑制骨质疏松症期间BMSCs的成骨分化，导致骨形成缺陷（Jing等人，2018年）。先前的一项研究报告称，含有DEP结构域的mTOR相互作用蛋白（DEPTOR）通过转录调控促进BMSCs的分化，从而加剧了骨脂紊乱（Ouyang等人，2022年）。因此，BMSCs的成骨/成脂分化可能是治疗PMOP的关键靶点。

雌激素信号通路与自噬之间存在密切关联。雌激素可以通过直接相互作用或影响雌激素受体的下游因子来调节自噬，同时自噬释放的脂质又是雌激素合成前体的关键来源（Zhao等人，2024年）。先前的研究表明，雌激素缺乏会导致自噬抑制，而雌激素补充可以促进自噬以增加骨细胞活力（Florencio-Silva等人，2018年）。此外，与年龄相关的骨丢失与自噬积累有关，这会导致骨量和骨强度随年龄下降，因此自噬被认为是治疗骨质疏松症的有希望的靶点（Wang等人，2019年）。二甲双胍已被证明可以通过恢复自噬通量来缓解PMOP（Yang等人，2024年）。

mTOR通过整合上游信号来维持细胞代谢稳态和生命的基本活动，促进代谢并抑制自噬。靶向过度激活的mTOR可以改善多种代谢疾病（Liu等人，2024a）。此外，mTOR通路已被证明通过多种途径调节自噬，并影响骨质疏松症的发展，而mTOR复合体1通过负调节AMPK来影响自噬通量（Chen等人，2024年）。AMPK是能量代谢的关键调节因子，通过生物能量通路维持细胞稳态，是代谢缺陷相关疾病的有希望的药物靶点（Smiles等人，2024年）。Cladrin已被证明可以通过AMPK/mTOR通路诱导自噬来减少成骨细胞凋亡并增加骨形成（Rai等人，2022年）。Phorbol-12-Myristate-13-Acetate-Induced Protein 1（PMAIP1）通过AMPK/mTOR通路抑制成骨细胞自噬，从而加重骨质疏松症（Gao等人，2024年）。然而，AMPK-mTOR-自噬通路在PMOP中的作用尚未得到研究。

淫羊藿是一种传统中药，淫羊藿素（Ica）是其主要的黄酮类成分。Ica具有多种药理活性，包括抗癌、调节脂质代谢和保护骨骼（Li等人，2015年）。作为植物雌激素，Ica可以通过与成骨细胞中的雌激素受体相互作用发挥雌激素效应（Wong等人，2023年）。研究表明Ica可以抑制成骨分化并促进骨骼再生（Wang等人，2024年）。Si等人发现Ica通过靶向Cullin 3/Nrf2/OH通路抑制破骨细胞的生成，从而改善骨质疏松症（Si等人，2024年）。此外，Ica改变了Spi-1原癌基因（SPI1）缺失对自噬和成骨前体细胞成骨分化的抑制作用（Zhang等人，2024b）。另一项研究表明Ica通过mTOR/自噬通路诱导BMSCs的成骨分化并缓解骨质疏松症（Liu等人，2024b）。此外，Ica通过AMPK/mTOR通路激活自噬并改善心脏肥大（Hu等人，2022年）。然而，Ica是否通过AMPK-mTOR-自噬通路调节PMOP中BMSCs的成骨/成脂分化尚不清楚。

在本研究中，建立了卵巢切除（OVX）小鼠模型来评估Ica对PMOP和BMSCs成骨/成脂分化的影响，并进一步通过AMPK-mTOR-自噬通路探讨其机制。

部分摘要

动物分组和处理

从北京HFK生物技术有限公司获得了50只雌性C57BL/6小鼠（20–30克，12周龄）。这些小鼠在无特定病原体的标准环境中饲养。适应一周后，建立了OVX小鼠模型。在卵巢切除术前，给小鼠腹腔注射80毫克/千克的Zoletil 50进行麻醉。在小鼠下腹部中线处做切口，然后切开皮下组织并钝性分离皮肤和肌肉

Ica促进了OVX小鼠的骨形成并减少了脂肪含量

通过微CT分析小鼠的骨量变化。与对照组小鼠相比，OVX小鼠的骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th）显著降低，而小梁间距（Tb.S）增加（图2A），表明OVX模型建立成功。Ica处理以剂量依赖的方式显著缓解了OVX小鼠的骨量丢失（图2A），表明Ica对PMOP具有治疗效果。然而，OVX诱导和Ica

讨论

破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成之间的平衡决定了骨量，它们的失衡会导致代谢性骨骼疾病，如PMOP（Balogh等人，2024年）。BMSCs由于具有分化为成骨细胞的潜力，可以促进骨骼再生（Li等人，2022年）。在本研究中，Ica增加了OVX小鼠的骨量，提高了小鼠来源的BMSCs的成骨分化潜力，并抑制了其成脂分化潜力

结论

Ica通过调节BMSCs的成骨/成脂分化来改善PMOP，其潜在机制可能涉及AMPK-mTOR-自噬通路。

CRediT作者贡献声明

曾玉清：撰写——原始草案、研究设计、资金获取、数据分析、概念构思。王海涛：数据可视化、资源获取、方法学、数据管理。胡静涛：数据可视化、项目管理、数据分析。阮伟伟：数据分析。姚志成：软件使用、数据管理。姜斌峰：数据可视化、资源获取。邓舒：撰写——审稿与编辑、项目管理、研究设计、概念构思。

伦理声明

本研究获得了浙江中医药大学动物伦理与福利委员会的批准（20230123–07）。

资助

本工作得到了浙江省中医药科学技术项目（资助编号：2025ZL025）和浙江省基础公共研究基金会（资助编号：LGF22H270009）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。