《Autophagy》：Expression of IMD-CBM peptide induces the autophagic degradation of CAV1 (caveolin 1) to inhibit LDL transcytosis and retard diabetic atherosclerosis
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本文介绍了一种新型融合肽IMD-CBM在糖尿病动脉粥样硬化中的创新治疗机制。研究揭示IMD-CBM能同时结合CAV1（caveolin 1）与LC3B，诱导CAV1的选择性自噬降解，抑制高糖环境下LDL（low-density lipoprotein）的跨内皮转运（transcytosis），从而在细胞与动物模型中有效延缓动脉粥样硬化斑块的形成。该发现为糖尿病心血管并发症的防治提供了新的潜在转化策略。
合成与表达IMD-CBM的腺病毒
研究首先设计并合成了新型融合肽IMD-CBM，它由CAV1的胞内结构域（intramembrane domain, IMD）和LC3B的CAV1结合基序（CAV1-binding motif, CBM）连接而成。其理论作用机制是：CBM部分与CAV1的脚手架结构域（CSD）结合，阻断内源性CAV1与LC3B的相互作用；而IMD部分则与LC3B结合，激活自噬，最终形成LC3B-IMD-CBM-CAV1复合物，引导CAV1进入自噬体被选择性降解。研究人员构建了表达IMD-CBM的腺病毒（Ad-IMD-CBM）。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，Western blot和共聚焦显微镜证实Ad-IMD-CBM能有效过表达IMD-CBM，且该肽主要定位于细胞膜。预实验确定了最佳感染复数（MOI）和干预时间。初步研究还发现，Ad-IMD-CBM对动脉粥样硬化相关的炎症因子（如TNF-α、IL6、IL10）及NF-κB通路关键分子的影响甚微。
IMD-CBM抑制HUVECs中的LDL跨内皮转运与摄取
接下来，研究评估了IMD-CBM对低密度脂蛋白（LDL）转运过程的影响。在高糖（25 mmol/L）条件下培养的HUVECs中，LDL的跨内皮转运显著增加，而Ad-IMD-CBM的干预逆转了这一效应。同时，利用DiI标记的LDL观察细胞对LDL的摄取，发现高糖环境显著增强了HUVECs内的红色荧光信号（代表被摄取的LDL），而IMD-CBM处理则显著降低了该荧光强度。这些结果表明，IMD-CBM能够抑制高糖诱导的LDL跨内皮转运和内皮细胞对LDL的摄取。
IMD-CBM与CAV1及LC3B的直接相互作用
为阐明IMD-CBM的作用机制，研究验证了其与靶蛋白的结合能力。免疫共沉淀实验证实，IMD-CBM能够同时与CAV1和LC3B蛋白结合。共聚焦显微镜图像进一步显示，IMD-CBM（绿色荧光）在细胞膜上与CAV1（红色荧光）及LC3B（红色荧光）存在显著的共定位。这些发现为IMD-CBM通过形成三元复合物发挥功能提供了直接证据。
IMD-CBM刺激CAV1的自噬性降解
基于IMD-CBM能同时结合CAV1和LC3B的发现，研究推测其能引导CAV1进入自噬-溶酶体途径降解。实验表明，在HUVECs中过表达IMD-CBM后，CAV1的蛋白水平显著下降。使用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）追踪蛋白半衰期，发现IMD-CBM使CAV1的半衰期从8.43小时缩短至4.77小时，表明其加速了CAV1的降解。免疫电镜结果显示，IMD-CBM促进了CAV1在自噬溶酶体中的聚集，在高糖环境下此效应更为明显。此外，使用溶酶体荧光探针LysoTracker的实验发现，IMD-CBM促进了GFP标记的CAV1在酸性细胞器中的积累。这些数据共同证明，IMD-CBM通过削弱CAV1的稳定性，刺激了其自噬性降解。
IMD-CBM通过降解CAV1促进自噬
CAV1的减少已被证实可促进内皮细胞自噬。因此，研究进一步探讨了IMD-CBM对自噬的影响。透射电镜观察显示，IMD-CBM处理显著增加了细胞内的自噬体和/或自噬溶酶体数量，并减少了细胞膜上的小窝（caveolae）数量。在分子水平上，IMD-CBM降低了自噬底物SQSTM1/p62的蛋白水平，同时增加了自噬标记物LC3B-II的水平，表明自噬被激活。机制上，IMD-CBM处理降低了AKT和MTOR（mechanistic target of rapamycin kinase）的磷酸化，增加了PRKAA/AMPK（5′-adenosine monophosphate-activated protein kinase）的磷酸化以及PIK3C3/VPS34（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3）的表达，提示其可能通过AMPK-MTOR-PIK3C3和PI3K-AKT-MTOR信号通路调控自噬。
为了考察自噬流（autophagic flux），研究使用了溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1）。结果显示，巴弗洛霉素A1处理后，CAV1、SQSTM1/p62和LC3B-II的蛋白水平均上调，且在IMD-CBM过表达的细胞中这种上调更为显著。同时，巴弗洛霉素A1也使IMD-CBM过表达细胞中的GFP-LC3斑点数量进一步增加。最后，利用对pH敏感的双荧光报告系统（GFP-RFP-LC3B）检测自噬流，发现IMD-CBM处理显著增加了细胞中黄色（自噬体）和红色（自噬溶酶体）斑点的数量，其效果与自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin）类似。这些结果证实，IMD-CBM通过降解CAV1有效促进了完整的自噬流。
IMD-CBM通过自噬降解CAV1改善糖尿病apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化
为了在体验证IMD-CBM的效果，研究团队构建了糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型（链脲佐菌素STZ诱导的apoe-/-小鼠）。通过尾静脉注射靶向内皮细胞的Ad-IMD-CBM或对照腺病毒进行干预。
结果发现，与对照组相比，糖尿病小鼠的主动脉斑块沉积显著增加。而Ad-IMD-CBM干预显著减少了糖尿病小鼠主动脉整体（en face）和主动脉根部的斑块面积（通过油红O染色评估）。体内免疫荧光显示，IMD-CBM在小鼠主动脉内皮细胞中高表达，并与CAV1和LC3B共定位。免疫组化分析进一步表明，IMD-CBM促进了主动脉中LC3B的表达，抑制了CAV1和SQSTM1/p62的表达。透射电镜对主动脉组织的观察显示，糖尿病小鼠主动脉中自噬泡较少而小窝较多；IMD-CBM干预后，自噬泡数量显著增加，小窝数量减少。此外，研究还观察到IMD-CBM干预后，糖尿病apoe-/-小鼠的血糖水平有所下降，但对甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）以及系统性炎症指标（CRP、SAA、TNF、IL6、IL10）的影响不大，提示其安全性。综合来看，IMD-CBM通过在体内促进CAV1的自噬性降解，激活自噬，从而改善糖尿病动脉粥样硬化。
讨论
本研究合成的新型融合肽IMD-CBM，通过同时结合CAV1和LC3B，形成了引导CAV1进入自噬途径降解的“桥梁”。其作用机制在于：CBM竞争性结合CAV1的CSD，阻断其抑制自噬的作用；而IMD则与LC3B结合，激活自噬并“招募”CAV1进入自噬体。最终，通过增强CAV1的选择性自噬降解，减少细胞膜上介导LDL转运的小窝形成，从而抑制LDL的跨内皮转运，延缓动脉粥样硬化的发生发展。
文章也探讨了选择腺病毒作为表达载体的原因，以及IMD-CBM在调节血糖、改善内皮功能（如一氧化氮NO释放）方面的潜在作用。同时，作者指出了本研究的局限性，例如IMD-CBM因含大量疏水氨基酸而无法直接化学合成，必须依赖病毒转染；其对血糖血脂调节及斑块成分影响的具体机制尚需进一步探索。
总之，该研究不仅深化了对糖尿病动脉粥样硬化发病机制的理解，更重要的是提供了一种基于靶向蛋白质降解和自噬调控的创新肽类治疗策略，具有重要的转化医学潜力。
