《Autophagy Reports》：TFEB confers resistance against the chemotherapeutic agent CX-5461
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本研究揭示了转录因子EB（TFEB）作为癌细胞应对化疗药物诱导的核仁应激的关键保护因子。文章发现，化疗药吉西他滨（gemcitabine）和新型核仁应激诱导剂CX-5461均可触发TFEB核转位，激活自噬-溶酶体通路，从而削弱药物疗效。干扰TFEB则能显著提高癌细胞对这两种药物的敏感性。这表明，靶向TFEB是克服由核仁应激介导的化疗耐药（chemoresistance）的一个极具前景的普适性策略。
背景：化疗耐药的挑战与TFEB的潜在角色
抗癌治疗常因癌细胞固有的或获得性的药物耐药性而效果不佳。此前研究已知，化疗药物吉西他滨能诱导癌细胞自噬并增强溶酶体活性，作为保护机制对抗药物。这些保护性信号依赖于自噬和溶酶体生物合成的核心调控因子——转录因子EB（TFEB）。然而，吉西他滨如何触发这些保护反应仍不清楚。尽管吉西他滨主要目标是破坏DNA复制，但它也被怀疑会诱导核仁应激。核仁是无膜细胞器，在核糖体生成和组装中起关键作用。靶向核糖体DNA（rDNA）转录的抑制剂，如选择性RNA聚合酶I（RNA Pol I）抑制剂CX-5461，已被开发为抗癌策略。本研究旨在探究吉西他滨对核仁应激的影响，并检验核仁应激诱导剂CX-5461是否能触发TFEB依赖的保护信号。
吉西他滨与CX-5461均可诱导核仁应激
为了验证吉西他滨是否引起核仁应激，研究人员检测了核仁结构。典型的核仁应激特征包括核仁变圆以及核仁蛋白如核仁素（NCL）和核磷蛋白（NPM1）从核仁重新定位到核质。实验发现，用吉西他滨处理的HeLa细胞表现出圆形的核仁，核仁内NPM1染色强度降低，而核质中增加。这种染色模式与已知的核仁应激诱导剂放线菌素D的效果相似。在HeLa和MIA PaCa-2细胞中，用吉西他滨处理也检测到NCL的类似核质重分布。值得注意的是，当细胞暴露于CX-5461时，NCL向核质的染色更为明显。这些结果支持了吉西他滨和CX-5461均可诱导核仁应激，尽管两种药物表现出不同的核仁表型。
研究还探讨了CX-5461是否像吉西他滨一样诱导DNA损伤。在CX-5461孵育的细胞中检测到DNA损伤标志物γH2AX水平升高，尽管程度低于吉西他滨处理。CX-5461在促进DNA-PKcs磷酸化方面的效果不如吉西他滨，且未检测到ATM磷酸化。不过，吉西他滨和CX-5461都导致了CHK2磷酸化水平增加。细胞生长实验（结晶紫染色法）证实，两种药物均能有效抑制HeLa和MIA PaCa-2细胞的生长。
CX-5461对自噬和溶酶体功能的影响
接下来，研究人员检验了核仁应激源CX-5461是否能复制吉西他滨处理所观察到的自噬和溶酶体功能诱导。在HeLa细胞中，暴露于吉西他滨和CX-5461导致LC3B-II水平增加，同时新形成自噬体的标志物磷酸化ATG16L1（p-ATG16L1S278）和溶酶体活性标志物成熟CTSB水平升高。此外，在药物处理的细胞中，LC3B和LAMP1斑点的积累支持了自噬体增加和溶酶体网络扩张。通过使用巴弗洛霉素A1监测自噬流，发现与单独使用巴弗洛霉素A1相比，其与吉西他滨或CX-5461共孵育时，LC3B-II和SQSTM1/p62水平显著增加，表明自噬流增强。尽管CX-5461在HeLa细胞中显著促进自噬流，但在MIA PaCa-2细胞中效果不一致，这可能与胰腺癌细胞中较高的基础自噬水平掩盖了细微变化有关。值得注意的是，CX-5461在增加成熟CTSB水平（指示溶酶体功能增强）方面表现出与吉西他滨相似的效力。
此前研究已证明，吉西他滨通过TFEB依赖的机制促进成熟CTSB和溶酶体功能。TFEB和TFE3等转录因子E家族成员通过磷酸化状态的改变响应应激，使其在细胞核中积累，从而启动促进自噬和溶酶体功能的转录程序。通过分析SDS-PAGE上的电泳迁移率来评估TFEB和TFE3的磷酸化水平变化，发现吉西他滨和CX-5461导致了TFEB低分子量形式的富集，表明TFEB磷酸化状态改变。这种迁移模式与mTOR抑制剂Torin1诱导的模式不同。TFE3的电泳迁移加速也在吉西他滨和CX-5461处理的细胞中检测到。
为了将电泳迁移率改变与TFEB核富集联系起来，研究人员进行了免疫荧光和亚细胞组分分离分析。在稳定表达V5标签TFEB（TFEB-V5）的HeLa细胞中，与对照细胞相比，暴露于吉西他滨或CX-5461后，TFEB染色主要定位于细胞核。核仁应激诱导剂放线菌素D也促进了TFEB核染色。此外，亚细胞组分分离显示，与对照细胞相比，在吉西他滨或CX-5461孵育的HeLa和MIA PaCa-2细胞的核组分中，TFEB低分子量形式水平更高。值得注意的是，PDAC细胞中已报道有较高的基础核TFEB水平，这可能解释了MIA PaCa-2细胞在吉西他滨和CX-5461暴露后核TFEB倍数变化不那么显著的原因。这些结果表明，CX-5461与吉西他滨相似，促进了TFEB的核积累。
干扰TFEB使癌细胞对CX-5461敏感
为了确定TFEB是否赋予对CX-5461处理的抵抗性，研究人员使用了稳定表达靶向TFEB的shRNA的细胞群。与对照细胞相比，HeLashTFEB和MIAshTFEB细胞的TFEB水平降低（约50%），而TFE3水平没有明显变化。这些TFEB敲低细胞的克隆形成生长能力降低。吉西他滨和CX-5461处理进一步限制了细胞的克隆形成生长。在测试的最低CX-5461浓度下，shTFEB细胞的克隆形成生长始终比shNT对照细胞少约50%；而在使用的最高CX-5461浓度下，shTFEB细胞的克隆形成生长能力比对照低60%。这些结果表明，干扰TFEB使细胞对诱导核仁应激的化疗药物吉西他滨和CX-5461更加敏感。
早期研究曾报道CX-5461诱导自噬，但未直接测量自噬流，因此其效果不明。且这些研究将自噬反应与CX-5461的细胞毒性相关联。在本研究中，HeLa细胞对CX-5461表现出持续增强的自噬流，而MIA PaCa-2细胞的自噬反应不一致。然而，两种细胞系都显示出对CX-5461的细胞毒性，表明细胞毒性可能在没有明确定义的自噬反应的情况下发生。因此，本研究结果更符合其他研究的观点，即自噬诱导抑制而非增强了CX-5461的抗癌效果。
尽管自噬反应因癌细胞系而异，但CX-5461对TFEB的影响具有高度可重复性。事实上，提示TFEB去磷酸化的电泳迁移加速是持续的，并且比自噬流的增加出现得更早。干扰TFEB放大了CX-5461和吉西他滨的细胞毒作用，这表明TFEB——可能超越自噬调控——可以作为保护性反应的更广泛指标。
一项近期研究显示，TFEB对CX-3543（一种破坏NCL与rDNA G-四链体复合物相互作用从而抑制RNA Pol I转录的小分子）具有细胞保护作用。尽管CX-3543与CX-5461作用机制不同，但该结果强调了干扰RNA Pol I与TFEB调控之间的潜在联系。然而，CX-5461影响TFEB的机制仍有待确定。虽然CX-5461的主要靶点是RNA Pol I对rDNA转录的起始，但一些研究表明CX-5461能稳定G-四链体并促进拓扑异构酶中毒。鉴于本研究中使用的CX-5461浓度与影响这些靶点的报道浓度相当或更低，需要进一步研究明确CX-5461的这些报道效应是否促进了TFEB功能。
在本研究中，由化疗药物吉西他滨和CX-5461诱导的TFEB依赖性保护反应都与核仁应激相关。由于RNA Pol I抑制剂CX-3543也触发了核仁应激和TFEB细胞保护反应，这提示TFEB可能代表针对核仁应激的保护信号。许多由核仁应激诱导的保护信号被归因于p53，尽管p53非依赖性的信号也已出现。与另一项报道CX-5461诱导p53依赖性保护信号的研究不同，本研究意味着该试剂也诱导不依赖于功能性p53的耐药机制。在此背景下，本研究结果表明另一个转录因子，即TFEB，可能作为核仁应激的传感器。解析核仁应激如何导致TFEB激活将为TFEB调控提供新的有趣的机制见解。它可能揭示先前未被认识的调控机制，同时确定如mTORC1、ERK或AMPK等已知通路是否将核仁应激与TFEB调控联系起来。吉西他滨和CX-5461暴露后观察到的TFEB电泳迁移率变化（与Torin1相比）表明，mTORC1依赖的机制不太可能参与其中，尽管需要进一步验证。
总之，与其他认为CX-5461可能规避耐药机制的观点相反，本研究表明这种有前景的抗癌剂诱导了TFEB依赖的保护性反应。由于TFEB与吉西他滨和CX-3543应答的化疗耐药机制相关，本研究结果强调了探索TFEB作为提高各种化疗药物（特别是那些诱导核仁应激的药物）效率的有吸引力策略的重要性。
