《Bioanalysis》：2025 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis: What is the Future of Bioanalytical LIMS? AI/ML Integration in Bioanalysis; Tear Sample Collection; Radiolabeled Mass Balance Studies; Chiral Assays; Bioanalysis of Antibody-Oligonucleotide & Bicycle Drug Conjugates (PART 1A – Recommendations on Mass Spectrometry Assays, Chromatography, Sample Preparation and Regulated Bioanalysis Sampling, Validating, Analyzing & Reporting PART 1B – Regulatory Agencies’ Input on Regulated Bioanalysis/BMV)
编辑推荐：
本白皮书是第19届生物分析热点问题研讨会（19thWRIB）的成果总结，汇集了全球1200多位制药/生物技术公司、CRO及监管机构专家的深入讨论。它围绕质谱（MS）分析、色谱技术、样品制备、人工智能/机器学习（AI/ML）整合、生物标志物定量等前沿议题，提出了一系列实用建议与共识，旨在为生物分析领域应对新兴复杂疗法（如基因/细胞疗法、疫苗）的挑战提供关键解决方案，推动行业科学卓越、质量提升与法规遵从。
1. 质谱分析、色谱法与样品制备
本部分聚焦于如何利用先进技术提升生物分析的效率与质量，并应对新兴分析物的挑战。
1.1. AI/ML在生物分析中的整合
人工智能与机器学习正变革药物发现与生物分析流程。在生物分析中，AI/ML的潜在应用包括优化化合物设计、预测非临床生物分析方法、以及自动化报告撰写等任务，以提升效率和数据质量。例如，利用AI可预测小分子药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性，从而在合成前筛选出更优的候选化合物。在方法开发中，基于历史数据训练的模型可帮助预测适用于新化合物的“最佳方法”参数。
然而，AI/ML模型的成功应用依赖于大量高质量、标准化的数据，以及明确的实施目的。关键挑战包括数据可及性、模型过拟合或欠拟合的风险，以及在受监管环境中缺乏明确的验证指南。与会专家建议，在受监管环境中部署AI/ML工具前，应咨询监管机构。目前，美国FDA的指导草案和《良好自动化生产实践》（GAMP）5（第二版）指南为AI验证提供了初步框架。同时，IT、质量保证（QA）和供应商应作为关键利益相关方参与讨论，以确保解决方案的合规性与可靠性。
1.2. 人体放射性标记质量平衡研究及其对规范生物分析的启示
人体放射性标记质量平衡研究（hADME）对于理解药物在人体内的命运至关重要。最新的美国FDA指南对此类研究的设计、执行和解读提出了明确要求。加速器质谱（AMS）因其极高的灵敏度，已成为hADME研究中，特别是结合静脉注射微示踪技术进行绝对生物利用度（ABA）测定的有力工具。
尽管AMS应用广泛，但目前尚缺乏针对其在规范生物分析中使用的正式指南。专家共识认为，行业应积极发表数据，比较AMS与传统技术（如液相闪烁计数法）在hADME研究中的表现，为监管提交提供依据。对于使用AMS的方法，建议采取“适合目的”的验证策略：使用国际认证的14C/12C标准品进行仪器校准；方法学确证应包含精密度、准确度、选择性、残留、稳定性等；样本分析时，每批应包含校准品、质控品（QC）和系统适用性测试。接受标准可参考配体结合分析（LBA）的惯例。
1.3. 发现生物分析的现代化/创新及其对规范生物分析的影响
药物发现领域的复杂性与日俱增，驱动着临床前分析方法的现代化。现代化的核心在于通过模块化自动化、端到端机器人技术和高通量质谱（HTMS）来提高工作流程的稳健性、重现性和通量，同时减少人工操作时间。例如，声学喷射高分辨质谱（AE-HRMS）可以省去色谱分离步骤，极大缩短分析时间。
此外，自动化生物样本存储系统通过减少人工处理、提高样本追踪精度，在保障样本完整性方面发挥着关键作用。虽然目前并非所有实验室都对这类自动化系统进行“完全验证”，但基于风险评估的“适合目的”的确认是可以接受的。在药物生产质量管理规范（GMP）环境下，则需要更严格的验证，包括温度分布图验证。
1.4. 手性分析的生物分析挑战
对于存在手性中心的药物，如果其对映体在药效、药代动力学或安全性方面存在显著差异，则有必要开发手性分析方法进行区分和定量。评估手性中心对活性、效价、安全性和清除率的影响应在药物开发早期进行。
除了常规的液相色谱-质谱联用（LC-MS）外，也应考虑使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和超临界流体色谱-质谱联用（SFC-MS/MS）等技术进行手性分离。案例研究表明，即使在没有SFC-MS设备的合同研究组织（CRO），通过使用合适的手性柱和正相或反相色谱条件，也可以成功建立并验证用于支持临床药代动力学研究的手性生物分析方法。
1.5. 质谱在糖类、转基因和免疫原性分析中的高级应用
糖类分析：糖类可作为肠道渗透性的生物标志物。由于糖类存在手性中心且缺乏可离子化基团，其分析面临挑战。若药物或标志物存在具有不同活性的立体异构体，或易于发生手性翻转，建议在临床前阶段尽早启动立体异构体选择性分析。在开发单一对映体药物时，临床二期是确认潜在手性翻转的合适阶段。
转基因分析：对于基因治疗中体内表达的转基因蛋白产物，质谱分析可用于验证其氨基酸序列、表征截短形式或翻译后修饰（PTMs）。在近乎天然条件下的质谱分析能保留蛋白质结构和非共价相互作用，有利于完整蛋白和复合物的表征，但灵敏度较低，数据解析也更为复杂。
免疫原性分析：高灵敏度、高特异性的质谱分析可作为LBA检测抗药物抗体（ADA）的补充方法，用于确认意外的免疫反应并进行更深入的表征（如同种型分析）。质谱还有助于识别免疫原性的潜在原因，如同种型、免疫复合物、PTMs、剪切片段、宿主细胞蛋白（HCPs）和其他杂质。
1.6. 克服通过免疫亲和-质谱法测定翻译后修饰的挑战
翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）是疾病机制和药物关键质量属性（CQA）的重要组成部分。
对于蛋白质磷酸化的定量，质谱平台在测定位点特异性磷酸化方面具有独特优势。支持相对定量时，可使用位点特异性磷酸化肽段作为校准品，总蛋白则可通过替代肽段法定量。建议纳入内源性QC以确保方法的可重复性和稳定性。捕获试剂需仔细选择，以避免同时定量总蛋白和磷酸化形式时因磷酸化状态不同而产生的干扰。
糖基化，尤其是高甘露糖型，是影响抗体清除率的关键CQA。可采用完整蛋白分析或自下而上（Bottom-up）的肽段分析策略来评估糖基化。相关的体外模型可用于预测糖基化对抗体清除的影响。应监管机构要求，可在临床前研究中评估体内CQA。
1.7. 组织中内源性蛋白生物标志物的复杂定量
在组织中定量内源性蛋白生物标志物对于理解药物作用机制至关重要。质谱分析因其能够同时定量多个标志物和特定蛋白修饰而成为有力工具。
选择配体结合分析还是质谱分析，需综合考虑靶标性质、高质量亲和试剂的可用性、基质、检测目的、灵敏度及成本等因素。对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，需注意交联对蛋白提取和下游分析的影响。定量内源性蛋白需要使用替代基质中的校准品，因此结果是与校准品相关的相对定量。建议优先使用内源性质控材料。
方法学验证必须确认灵敏度、特异性与可重复性。激光捕获显微切割等靶向组织提取技术应整合到从样本到结果的整体方法验证中。归一化策略取决于具体应用，可选择总蛋白、特定的“看家”蛋白、或已知表达分析物的细胞亚群中的蛋白标志物。在显微切割样本中，也可使用细胞数量或组织面积/体积进行归一化。
2. 质谱分析
本部分深入探讨了针对特定复杂分析物（如siRNA、抗体-寡核苷酸偶联物等）的质谱分析策略与挑战。
2.1. 生物标志物分析中的非特异性吸附
对于生物标志物质谱分析中非特异性吸附的可接受标准，尚未达成统一的数字界限。重要的是在方法开发阶段评估其影响，并采取缓解策略（如使用表面活性剂、硅烷化容器、或添加载体蛋白）。测试浓度通常应覆盖定量范围，包括定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）。
2.2. 评估ADC药物中含内酯有效载荷的化学结构
对于含有内酯环的化合物（如某些抗体偶联药物的有效载荷），在体内外条件下可能发生内酯（闭环）与羧酸盐（开环）形式的相互转化。是否需要分别测定两种形式，取决于它们是否具有不同的药理学活性或药代动力学行为。如果两种形式在体内快速平衡，且活性相当，则可以开发测定总暴露量的方法。关键是在方法开发早期了解其转化动力学，并选择能够稳定样品状态的条件（如pH控制、快速处理）。
2.3. 克服提取回收率挑战
较低的提取回收率（例如20%）但具有高重现性，有时是可以接受的，前提是方法经过充分验证（包括精密度、准确度、选择性），并且不影响定量的灵敏度和可靠性。关键在于回收率的一致性和内标（IS）的有效校正。异常高的回收率（>130%）可能表明存在共洗脱干扰或内标选择不当，需要进行调查。
2.4. siRNA疗法的新型生物分析策略
脂质共轭siRNA的分析可采用免疫亲和-质谱联用或固相萃取-液质联用等方法。选择合适的稳定同位素标记内标对于准确定量至关重要。杂交-质谱法和杂交ELISA是寡核苷酸分析的常用技术，两者各有优劣：质谱法能区分截短代谢物，而ELISA通常检测全长序列。方法间需要进行交叉验证和桥接研究。微流质谱能显著提高离子化效率，但需注意管路堵塞问题。样本前处理中，固相萃取和液液萃取都是可行的选择。
2.5. 抗体-寡核苷酸偶联物的生物分析
抗体-寡核苷酸偶联物（AOCs）的分析通常需要测定多个分析物：完整的偶联物、总抗体、以及释放的寡核苷酸（可能包括全长和代谢物）。这往往需要结合配体结合分析（用于总抗体和/或完整偶联物）和质谱或杂交分析（用于寡核苷酸部分）的混合策略。主要挑战包括避免分析物在样本处理过程中解离、以及开发能够准确定量完整但高度异质的偶联物的方法。
2.6. 双环肽药物偶联物的生物分析
双环肽药物偶联物（BDCs）的分析借鉴了抗体偶联药物（ADCs）的经验，但需适应其较小的分子尺寸和简单的1:1药物-肽比例。典型的分析策略包括使用质谱法分别定量完整的偶联物和释放的有效载荷，以全面了解其药代动力学和安全性。关键挑战在于区分细胞内（预期的）和细胞外（非预期的）有效载荷释放，这可能需要结合体外血浆稳定性研究和复杂的生物分析方法。
2.7. ADC的最新进展
对于ADC临床研究，通常的样本收集和处理流程是采集血清样本，然后分样分别用于有效载荷的质谱分析和抗体部分的配体结合分析。至关重要的是，在方法验证阶段确立ADC在血液/血清中的稳定性，以确定从采集到处理的允许时间窗口，确保分析物的完整性，从而获得可靠的数据。稳定性研究应模拟临床样本的处理条件。
