肠道菌群中的β-内酰胺酶基因库多样性：头孢曲松暴露患者预防产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌定植的新生态屏障

《Gut Microbes》：Pre-existing β-lactamase gene diversity is associated with lower risk of ESBL-producing Enterobacterales colonization in patients exposed to ceftriaxone

本文推荐给关注抗生素耐药性、肠道微生态与感染领域的读者。研究通过宏基因组测序前瞻性分析接受头孢曲松治疗的感染患者，首次提供真实世界证据，揭示基线时肠道“β-内酰胺酶组”（β-lactamasome）的基因多样性（而非特定细菌分类群）是抵抗产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌（ESBL-E）定植的独立保护因素。这挑战了传统以分类学多样性为核心的定植抵抗观念，强调了功能抗性组（resistome）的重要性，并为个体化预防策略提供了新思路。

　　

前言

抗生素耐药性是工业化国家面临的全球性健康重点问题，其中革兰氏阴性菌的耐药性尤为令人担忧，大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是导致耐药相关死亡的主要病原体之一。在这些菌种中，对β-内酰胺类抗生素（特别是第三代头孢菌素（3GC）和碳青霉烯类）的耐药性严重限制了治疗选择，增加了发病率、死亡率、住院时间和医疗成本。肠杆菌目（Enterobacterales）的β-内酰胺耐药性主要由水平获得的超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶编码基因驱动，这些基因在医疗机构和社区内传播。抗生素的广泛使用已被确定为在个体和群体水平上选择和传播产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌（ESBL-E）的关键驱动因素。第三代头孢菌素因其广谱活性而在全球成年住院患者中最常被处方，并已被证明会促进耐药肠杆菌的肠道定植。

人类肠道微生物组由细菌、古菌、病毒、真菌和原生动物组成的复杂群落构成，与宿主的关系从互利共生到寄生不等。这个微生物群落在健康个体中表现出时间稳定性，但多种因素可以改变其结构，包括年龄、生活习惯以及抗生素治疗等药物干预。人类肠道微生物组蕴藏着大量多样的抗生素抗性基因（ARGs）。这些ARGs可能以比其他环境更高的速率参与细菌间的水平基因转移，因此可能作为全球传播和被病原菌获取的储存库。共生菌中存在的ARGs也可能在抗生素暴露期间提供保护性优势，可能允许有益微生物在治疗中存活并保持定植抵抗。除了ARGs的这种潜在保护作用外，肠道微生物群还采用其他机制来抵抗病原体定植，包括竞争性排除、生态位占据、抗菌化合物的产生以及维持基本代谢功能。抗生素诱导的这种微生物屏障破坏，可能通过消除保护性共生菌种并改变肠道代谢环境，促进包括耐药肠杆菌在内的病原生物的建立和扩张。

即使通过肠外途径给药，一部分抗生素也会通过胆道排泄进入肠腔，在那里它们会显著影响肠道微生物组（包括细菌和ARGs）的组成。在临床实践中最广泛使用的抗生素中，第三代头孢菌素在健康志愿者研究中已被证明会显著破坏肠道微生物组，降低细菌多样性和丰富度、噬菌体丰富度和抗性组丰富度，同时增加β-内酰胺酶编码基因（“β-内酰胺酶组”）的相对丰度和总体β-内酰胺酶活性。然而，肠道微生物组具有恢复力，在健康个体中会在几周内恢复。中低收入国家的大规模人群研究表明，在头孢曲松暴露后，ESBL-E定植的特点是基线携带率高且持久性强。

鉴于抗生素、微生物组破坏和ARG动态之间的这种复杂相互作用，理解影响ESBL-E获得的微生物组因素变得至关重要。虽然ESBL-E获得的一些临床风险因素已经明确，包括既往第三代头孢菌素暴露、住院和合并症，但肠道微生物组在定植易感性中的作用仍然知之甚少。关于个体暴露于第三代头孢菌素后ESBL定植率的研究文献记载很少，并且迄今为止尚未发现与定植抵抗或易感性相关的特定微生物组特征，这与已描述了此类模式的其他病原体（如艰难梭菌（Clostridioides difficile）感染复发和肠球菌（Enterococcus）扩张）形成对比。

在本项前瞻性研究中，我们分析了暴露于头孢曲松的患者的肠道微生物组和抗性组，比较了随后在第30天获得ESBL-E定植的患者与未获得定植的患者。通过分析抗生素给药前、治疗期间和随访期间收集的样本，我们旨在识别可能易导致或防止ESBL-E获得的预先存在的微生物组、抗性组和β-内酰胺酶组特征。我们的次要目标是描述获得ESBL-E携带者和未获得者的肠道微生物组分类组成和抗性组组成的动态变化。

方法

队列描述与患者参与

患者队列源自ARCMI研究（Antimicrobial Resistance to 3^rdgeneration Cephalosporins and Intestinal Microbiota，临床试验.gov注册号NCT03569917，南特大学医院2018‐A00879‐46）。代表了研究设计的流程图。从2019年1月到2021年10月，纳入了南特大学医院急诊科（ED）或重症监护室（ICU）收治、因疑似细菌感染接受每日剂量1-2克肠外头孢曲松治疗的成年患者。排除标准包括：与直肠拭子采样不相容的急性肛肠疾病、每日头孢曲松剂量大于2克、炎症性肠病、或对β-内酰胺或头孢菌素过敏或禁忌。在首次给予头孢曲松时或开始治疗后30天没有样本可用的患者、接受头孢曲松治疗少于2天的患者以及基线拭子检出ESBL-E的患者被排除。

样本收集与处理

在急诊科或重症监护室入院当天，医生指示需使用头孢曲松的患者被考虑纳入。在三个时间点收集直肠拭子样本：第0天（抗生素给药前）、第5天和第30天。在每个时间点，当日通过直肠拭子采集两个样本。一个样本采集在eSwab（COPAN, Brescia, Italy）中送至细菌学实验室用于培养目的；另一个样本采集于干拭子上，立即储存在南特大学医院的生物资源中心（CRB, Nantes, France）的–80°C条件下。

细菌学方法

简而言之，使用标准化的选择性显色培养方法处理直肠拭子。将拭子在Cary-Blair运输培养基（COPAN, Brescia, Italy）中涡旋5-10秒，取固定接种量（100 μL）接种到ChromID ESBL琼脂平板（ChromID ESBL, BioMérieux, France）上。平板在有氧条件下36°C孵育48小时，并在24和48小时检查特征性菌落生长（粉色、棕色或蓝色菌落）。疑似产ESBL肠杆菌通过MALDI-TOF MS（MALDI-TOF Biotyper? Sirius IVD, Bruker Daltonics, Bremen, Germany）进行鉴定，并根据制造商说明使用MAST DISC-ESBL（Mast Diagnostics Ltd, Merseyside, UK）试验进行表型确认，以区分产ESBL肠杆菌和过量产AmpC肠杆菌。ESBL检测策略与常规临床微生物学实验室程序和现行欧洲建议一致。

临床数据分析

根据第30天的ESBL-E获得状态，使用单变量分析比较基线临床变量。连续变量使用Wilcoxon秩和检验进行比较，分类变量酌情使用χ2检验或Fisher精确检验。在单变量分析中与ESBL-E获得相关（p< 0.20）的变量，连同年龄和性别，被考虑用于多变量逻辑回归。最终模型被限制为有限数量的临床相关协变量以防止过拟合，结果以调整后的比值比（OR）和95%置信区间（CI）报告。

宏基因组分析

第二个冷冻拭子的DNA使用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（QIAgen, Cour-taboeuf, France）按照制造商说明进行提取。使用荧光测定法（Qubit? dsDNA BR检测试剂盒，ThermoFisher, Waltham, USA）对双链DNA进行定量，并使用Nanodrop 2000c（ThermoFisher, Waltham, USA）测定纯度。然后将样本冷冻在–80°C直至进一步分析。从含有最少70 ng DNA的样本制备DNA文库。

文库根据制造商的建议（Illumina, San Diego, California）制备，具体细节见补充材料。测序在GenoA测序平台（Nantes University, France）的NovaSeq 6000平台（Illumina, San Diego, California）上进行，使用2 × 150 bp读长。结果平均每个样本产生3.8（+/-1.3）Gbp数据，平均质量评分（QC）为35.4（+/-0.6）[最小值：32]，对应于中位数24.6[IQR +/-6.7]百万读段/样本。

生物信息学分析

使用Trimmomatic（版本0.36）去除低质量序列。使用Kraken2（版本2.1.3）比对标准数据库（版本20231009）识别宿主序列，并使用Kraken Tools（版本1.2）的extract_kraken_reads.py命令去除。总体而言，平均14.6（+/-8.6）M读段/样本被分配给原核生物域，6.4（+/-8.3）M读段/样本被分配给真核生物域（补充图1和补充表1）。最终的分类学谱分析使用mOTU（版本3.1.0）进行。通过使用ARIB A（版本2.14.7）的run命令、以默认参数针对结合了ResFinder 4.0和ResFinderFG2数据库（版本4.5.0和2.0）的自定义数据库运行本地组装来识别ARGs（补充材料）。使用CD-HIT（版本4.8.1）对合并后的数据库进行重复序列去除。使用自定义Python脚本计算每千碱基百万片段（FPKM）值。FPKM计算公式为（配对末端读段数 × 10?）/（基因长度 × 映射的配对末端读段总数），其中映射的配对末端读段总数代表所有映射到ARGs的读段数之和除以2。然后从识别的完整ARGs集中手动筛选感兴趣的β-内酰胺酶基因用于后续分析。由于ResFinderFG2条目源自功能宏基因组学实验，所有分析的β-内酰胺酶基因均对应于经过表型验证的抗性决定簇。与每个ARG相关的表型抗性从ResFinder 4数据库（https://bitbucket.org/genomicepidemiology/resfinder_db/src/master/phenotypes.txt）手动提取，而在ResFinderFG2数据库中识别的ARGs则通过BLAST（版本2.17.0）比对ResFinder 4数据库来分配表型抗性，以识别最接近的同源基因。为了推断从ResFinderFG2数据库中识别的β-内酰胺酶基因的假定分类关联，所有已映射的β-内酰胺酶基因的核苷酸序列均使用BLASTN查询NCBI RefSeq参考基因组数据库（补充材料）。

每个样本中细菌和ARGs多样性的估计在使用Seqtk软件（版本1.4）（https://github.com/lh3/seqtk）进行初始500万次读段的均一化后进行。使用veganR包（版本2.6-4）计算独特观察到的ARGs数和香农指数，并使用Dunnett检验（descToolR包，版本0.99.58）进行组间比较。使用phyloseqR包（版本1.44.0）计算布雷-柯蒂斯距离，并使用vegan包的adonis2函数进行比较。

差异丰度分析

为了识别获得ESBL-E的患者与未获得患者之间差异丰富的细菌种类和ARGs，我们使用了metagenomeSeq包（版本1.48.1）。原始计数数据被过滤，仅保留在至少三个样本中存在的物种。使用累积和标度（CSS）方法对过滤后的计数数据进行标准化，该方法专门用于处理微生物组数据的组成性和稀疏性。使用调整后的p值（Benjamini-Hochberg方法）确定统计显著性，以控制多重检验，阈值为<0.05。具有显著调整p值的物种被认为是获得ESBL-E的患者与未获得患者之间存在差异丰度。对于这些物种，计算log2倍数变化以量化差异丰度的大小和方向。进一步检查了所有样本中显著不同物种的个体丰度分布，以评估富集模式的一致性和识别潜在的异常值驱动效应。

为了根据第30天的ESBL定植状态来描述物种丰度的动态变化，我们使用MaAsLin2（微生物组多变量与线性模型关联，版本1.20.0）中实现的广义随机效应线性回归进行了纵向分析。将患者ID作为随机效应以考虑重复测量，而第30天的ESBL-E定植状态和采样时间作为固定效应。以FDR校正后p值 < 0.05识别的特征被认为是显著的。通过取丰度比值的以2为底的对数来计算log2倍数变化。

所有统计分析均在R环境（版本4.4.2）中进行，可视化使用ggplot2包（版本3.5.1）生成。

结果

队列描述以及与ESBL-E定植相关的参数

2018年12月至2021年10月期间，共筛查了4554名患者，总共143名患者符合纳入标准。51名患者被排除（）。7名患者的入组样本DNA量低于宏基因组测序所需的阈值。8名患者因基线样本ESBL-E阳性而被二次排除。

最终队列包括80名患者。12名基线时无ESBL定植的患者在第30天收集的样本中呈ESBL-E定植阳性（15%；95% CI 8.2%?25.0%）。在识别的产ESBL分离株中，我们发现了大肠杆菌（E. coli）（n= 3）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）（n= 4）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）（n= 3）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）（n= 3）。三名患者在第5天样本阳性但在第30天样本阴性。识别的菌种为阴沟肠杆菌（两名患者）和蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）。

纳入患者的人口统计学和特征见表1。我们首先调查了第30天ESBL-E状态与人口统计数据、临床特征和管理参数之间的潜在关联。35名（44%）入组患者在入组时接受了另一种抗生素与头孢曲松联合治疗，55名（69%）患者在头孢曲松暴露后更换了抗生素（补充图2）。

单变量分析显示，慢性肾脏病（p= 0.016）、急诊科联合使用其他抗生素（p= 0.02），特别是大环内酯类（p= 0.043），与第30天ESBL-E定植显著相关（表1）。多变量分析显示，只有慢性肾脏病仍然与ESBL-E定植独立相关（OR = 10.1 [95% CI: 1.6?65]，p= 0.015）（表1和补充图3）。

分类学多样性与ESBL-E获得无关

在该队列中总共识别出34,341个宏基因组操作分类单元（mOTUs）。所有患者在第0天至第30天的mOTUs水平上的α多样性指标均经历了显著且持续的下降（Dunnett检验，独特观察到的mOTUs，p值 < 10^?5；香农指数，p值 < 10^?5）（ a,b图）。

在mOTUs水平上的微生物α多样性指标在基线时，第30天获得ESBL的患者与未获得患者之间没有显著差异（Wilcoxon检验，香农指数，p= 0.9；独特观察到的mOTUs，p值 = 0.53）。此外，在每个时间点，接受序贯抗生素治疗的患者与仅用头孢曲松完成治疗的患者之间没有观察到显著差异（Wilcoxon检验，香农指数和独特观察到的mOTUs，所有p> 0.05（补充表2））。

然而，在急诊科接受另一种抗生素与头孢曲松联合治疗的患者在第5天和第30天的丰富度显著较低（补充表3， c图）。

在每个时间点，第30天ESBL-E携带者与未携带者之间的α多样性没有显著差异（补充表4）。同样，头孢曲松暴露期间（即基线与第5天之间）α多样性的变化在定植患者与未定植患者之间也不显著（独特观察到的mOTUs，-67 ± 82 vs -77 ± 56；香农指数，-0.90 ± 1.16 vs -0.82 ± 0.83；Wilcoxon检验，独特观察到的mOTUs和香农指数，p值 > 0.05）。第5天和第30天之间的恢复动态也未区分获得定植的患者和未获得定植的患者（独特观察到的mOTUs，-26 ± 97 vs -58 ± 101平均物种数；香农指数 -0.54 ± 1.2 vs -0.50 ± 1.49；Wilcoxon检验，独特观察到的mOTUs，香农指数，p值 > 0.05）。值得注意的是，定植和未定植的患者在30天随访后均未恢复到其初始的丰富度和多样性水平（Wilcoxon检验，独特观察到的mOTUs，ESBL-E阳性，p= 0.002，ESBL-E阴性，p< 10^?5；香农指数，ESBL-E阳性，p= 0.0005，ESBL-E阴性，p< 10^?5）。

使用布雷-柯蒂斯相异度，我们观察到微生物群的分类组成在头孢曲松暴露后对获得ESBL-E和未获得ESBL-E的患者均受到显著破坏（adonis检验，ESBL-E和非ESBL-E，p= 0.001）（ d图）。

在随访的每个时间点，包括基线，获得ESBL-E定植的患者与未获得患者之间的分类学结构没有显著差异（adonis；基线，p= 0.79，第5天p= 0.28，第30天p= 0.55）（补充图3）。

无针对ESBL-E获得保护性的分类学特征

使用metagenomeSeq进行的差异丰度分析显示，在随后获得ESBL-E的患者基线样本中，有九个mOTUs显著更丰富，log2FoldChanges范围从5.85到7.84（调整后p值 < 0.05），而只有一个mOTU（归属于Brevibacteriumspecies incertae sedis）在未获得者的样本中显著更丰富（a图和补充表5）。每个识别的物种在个体患者中的时间丰度变化见b图。

头孢曲松暴露后微生物群在物种水平上的动态变化

为了全面描述头孢曲松给药后个体物种水平发生的变化，我们使用MaAsLin2的混合效应模型进行了纵向比较分析。抗生素暴露后（即基线与第5天之间），我们识别出两种细菌物种，即鸟肠球菌（Enterococcus avium，ref_mOTU_v31_02620）和屎肠球菌/耐久肠球菌（Enterococcus faecium/durans，ref_mOTU_v31_00323），它们的丰度轨迹在ESBL-E+和ESBL-E-患者之间存在显著差异（MaAsLin2，FDR校正后p= 0.002 和 p= 0.030）（a图）。考虑整个随访期（D0至D30），我们识别出两种具有显著不同丰度轨迹的细菌物种，即鸟肠球菌[ref_mOTU_v31_02620]和微需氧戴阿利斯特杆菌（Dialister micraerophilus）[ref_mOTU_v31_06468]（MaAsLin2，FDR校正后p= 0.011 和 p= 0.035）（b图）。每个识别的物种在个体患者中的时间丰度变化见c图。

较高的β-内酰胺酶组多样性与抵抗ESBL-E获得相关

使用Resfinder 4和ResfinderFG2数据库的非冗余组合，我们在整个数据集中识别出1643个独特的ARG（n= 77个样本）（补充表6）。使用自定义数据库，我们在整个数据集中识别出245个独特的bla编码基因（n= 77个样本）。

基线抗性组多样性与ESBL-E获得之间无关联

在基线时，到第30天未获得ESBL-E的受试者与获得ESBL-E的受试者之间，ARGs丰富度和多样性均无显著差异（Wilcoxon检验，香农指数，2.42 ± 0.43 vs 2.31 ± 0.52，p= 0.40；独特ARGs数量，130.35 ± 49.5 vs 133.70 ± 61.1，p= 0.86）。头孢曲松暴露后（D5），所有患者均经历了ARGs丰富度的显著下降（Wilcoxon检验，独特ARGs数量，130.81 ± 50.8 vs 99.77 ± 45.8，p= 0.006），这种下降在随访结束时（D30）持续存在（Wilcoxon检验，独特ARGs数量，130.8 ± 50.8 vs 94.14 ± 33.9，p= 0.0005）（补充图5）。头孢曲松暴露后，ESBL-E阴性患者与ESBL-E阳性患者之间的丰富度或多样性均无显著差异（Wilcoxon检验，香农指数，p= 0.58；独特ARGs数量，p= 0.71），在随访结束时也是如此（Wilcoxon检验，香农指数，p= 0.44；独特ARGs数量，p= 0.97）。

较高的基线bla编码基因丰富度和多样性与未获得ESBL-E相关

在基线时，到第30天未获得ESBL-E的受试者与获得ESBL-E的受试者相比，在单变量分析中具有更高的β-内酰胺酶基因多样性（香农指数，1.19 ± 0.42 vs 0.98 ± 0.3，Wilcoxon检验，p= 0.041；独特bla编码基因数量，p= 0.44）（ a,b图）。为了评估这些关联是否独立于临床混杂因素，β-内酰胺酶编码基因多样性和丰富度分别被纳入最终的ESBL-E获得多变量临床模型中。在控制了年龄、性别、大环内酯类使用和慢性肾脏病后，多变量分析显示，较高的β-内酰胺酶编码基因多样性（香农指数，调整后OR = 0.12 [95% CI: 0.02–0.88]，p= 0.038）和丰富度（独特BLA基因数量，调整后OR = 0.79 [95% CI: 0.64-0.99]，p= 0.039）均与第30天ESBL-E获得减少独立相关（表2和补充图6、7）。

头孢曲松暴露后（D5），ESBL-和ESBL+个体之间的β-内酰胺酶编码基因多样性和丰富度具有可比性（丰富度：9.16 ± 4.6 和 8.4 ± 5.1，香农指数：0.99 ± 0.50 和 0.97 ± 0.54，Wilcoxon检验，p= 0.73 和 p= 0.70）。在30天随访时，多样性指标也没有差异（丰富度：10.16 ± 4.70 和 12.42 ± 4.56，香农指数：0.99 ± 0.50 和 0.97 ± 0.54，Wilcoxon检验，p= 0.39 和 p= 0.25）。

基线bla编码基因结构与ESBL-E获得无关

ESBL-E-和ESBL-E+患者之间基线时的β-内酰胺酶编码基因组成没有显著差异（adonis检验，R2 = 0.026，调整后p= 0.69）（ c图）。我们观察到头孢曲松暴露后（第5天，adonis检验，R2 = 0.03，调整后p= 0.71）和随访后（第30天，adonis检验，R2 = 0.034，调整后p= 0.16）也没有显著差异（补充图8）