一种基于酪氨酸酶响应激活纳米涂层的电化学生物传感器用于高灵敏度检测黑色素瘤生物标志物

《International Journal of Nanomedicine》：Tyrosinase-Responsive Activated Nano-Coated Sensor for Sensitive Detection of Melanoma Biomarkers

本文报道了一种用于高灵敏度检测黑色素瘤生物标志物——酪氨酸酶（TYR）的新型电化学生物传感器。作者通过设计酪胺功能化的羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-tyr）、金纳米颗粒（Au NPs）和导电聚合物PEDOT的复合纳米涂层，成功修饰丝网印刷电极（SPE）。该传感器不仅显著提升了导电性和催化活性，更利用TYR对酪胺的特异性催化转化机制（“底物集成”酶激活），将微弱的酶活信号放大为可检测的电化学信号。研究在磷酸盐缓冲液（PBS）和荷瘤小鼠血清样本中验证了其卓越性能，显示出宽线性范围（0.05~0.9 U/L）、极低的检测限（0.0091 U/L）及优异的选择性与重复性。更重要的是，在动物模型中，传感器检测到的血清TYR水平与肿瘤体积增长呈显著正相关，证明了其在黑色素瘤早期诊断和病情监测方面的巨大应用潜力。

　　

引言

作为一种高度恶性的皮肤癌，黑色素瘤因其早期症状隐匿、进展迅速且易发生远处转移的特点，显著降低了晚期患者的5年生存率。因此，实现黑色素瘤的早期诊断对于改善患者预后至关重要。在众多潜在的诊断标志物中，作为黑色素合成过程中的关键限速酶——酪氨酸酶（Tyrosinase, TYR），与黑色素瘤的发生发展密切相关，被认为是极具前景的早期诊断生物标志物。在正常情况下，TYR被严格限制在健康的黑色素细胞内，在周围循环中几乎检测不到。然而，在黑色素瘤状态下，恶性细胞的快速增殖和高代谢转换导致TYR异常释放并积累到血液中。尽管理论上微量的TYR活性可能源于正常皮肤代谢或其他非恶性色素性病变，但黑色素瘤患者的血清浓度（0.066~0.636 U/L）往往比生理基线（≤0.024 U/L）高出数个数量级。这种独特的病理性升高是利用循环TYR作为黑色素瘤筛查和分期特异性生物标志物的生物学基础。

目前，检测TYR的传统方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和高效液相色谱法（HPLC）等，但这些方法普遍存在操作繁琐、检测周期长、依赖大型仪器以及灵敏度不足等局限，难以满足临床对黑色素瘤快速、准确早期筛查的需求。相比之下，电化学生物传感器因其高灵敏度、快速响应、低成本及便携性等优点，在生物标志物检测领域展现出巨大应用潜力，尤其适用于基层医疗机构的即时检测场景。其中，丝网印刷电极（Screen-Printed Electrodes, SPEs）因其可大规模生产和易于表面修饰的特点，成为便携式传感器的理想平台。电极修饰材料的性能是决定电化学生物传感器检测性能的核心因素，然而传统的SPE存在电导率不足、界面电子转移效率低等问题，限制了其对痕量标志物的检测能力。

基于此，本研究旨在构建一种新型的酶响应激活型生物传感器，以解决上述挑战。其核心策略是：采用酪胺功能化的羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-tyr）作为特异性识别和信号传导单元，借助金纳米颗粒（Au NPs）和导电聚合物聚（3,4-乙撑二氧噻吩）（PEDOT）构建高导电性、高稳定性的复合纳米涂层，修饰于SPE表面，最终实现对血清中痕量TYR的高灵敏度、高特异性检测。与依赖空间位阻或简单吸附的传统免疫传感器不同，该策略利用了表面结合的酪胺被TYR特异性催化转化，从而触发“开启”式电化学信号的独特机制。

实验部分

材料与合成

研究中使用的所有化学品和试剂均为市售最高等级。通过酰胺反应将酪胺共价修饰到羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH）上，成功合成了MWCNTs-tyr。透射电子显微镜（TEM）显示，与未修饰的MWCNTs-COOH相比，酪胺修饰后的MWCNTs-tyr在形貌上没有显著差异，但引入酪胺显著改善了碳纳米管在水中的分散性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析在1634 cm^-1处观察到归属于酰胺键中C=O伸缩振动的新峰，同时在3347 cm^-1处观察到酪胺酚羟基和酰胺键N-H的伸缩振动增强，证实了MWCNTs-tyr的成功合成。

金纳米颗粒（Au NPs）通过柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备，并通过TEM确认其成功负载于MWCNTs-tyr表面，形成MWCNTs-tyr/Au复合材料。紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱进一步验证了酪胺和Au NPs的有效负载：MWCNTs-tyr在262 nm处出现特征吸收峰（对应于酪胺的酚基结构），而MWCNTs-tyr/Au在542 nm处保留了Au NPs的特征吸收峰，表明Au NPs的引入未影响酪胺的构象稳定性。

电极制备与表征

将MWCNTs-tyr/Au复合材料与导电聚合物PEDOT:PSS混合均匀，滴涂于SPE工作电极表面，干燥后得到MWCNTs-tyr/Au/PEDOT/SPE电极。扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）表征显示，复合涂层均匀覆盖于电极表面，与裸SPE电极相比，修饰后电极的整体粗糙度增加但局部高度变化减小，形成了更均匀的高度分布，这有利于降低传质阻力，促进TYR向电极表面活性中心的扩散。

结果与讨论

电化学性能研究

采用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）对不同修饰阶段的电极进行了电化学行为分析。结果显示，与裸SPE电极相比，MWCNTs-tyr/Au/PEDOT/SPE电极在含有5 mM [Fe(CN)₆]^3-/4-的溶液中的氧化还原峰电流显著增加，电荷转移电阻明显降低。在不同扫描速率下的CV测试表明，电极上的氧化还原过程具有准可逆性，证实了MWCNTs-tyr/Au/PEDOT/SPE电极的成功制备及其优异的电荷传输能力。

对酪氨酸酶的检测性能

利用差分脉冲伏安法（DPV）评估了传感器对TYR的检测性能。其检测机制基于“底物集成”的酶激活原理：固定在电极表面的酪胺在TYR的催化下发生邻位羟基化，转化为多巴胺；多巴胺的邻苯二酚结构在施加的DPV电位下发生可逆的两电子、两质子（2e^-/2H⁺）氧化过程，生成多巴胺-醌，从而产生可测量的阳极氧化电流。该电流的大小与表面生成的多巴胺浓度成正比，进而与血清中TYR的酶活性相关。

实验结果表明，该传感器对TYR表现出宽线性检测范围（0.05 – 0.90 U/L），线性相关系数（R²）为0.9914，检测限低至0.0091 U/L，灵敏度为20.27 μA U^-1L^-1。在稀释血清中的校准灵敏度达到在PBS中灵敏度的96.1%，加标回收率在96.0%至103.7%之间，证明了其在复杂生物基质中的准确性和抗干扰能力。

稳定性与抗干扰性能

传感器展现了良好的稳定性和重复性。在0.1 U/L的TYR浓度下，同一电极可重复测量5次，信号保持稳定；不同批次电极在长达4周的储存后，仍能保持初始响应值的90%以上0.05).">。特异性测试显示，传感器仅对TYR产生显著信号响应，而对血清中常见的干扰物质如L-酪氨酸、多巴胺、抗坏血酸、尿酸、S100B蛋白、牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖和乳酸等均无响应，甚至这些物质与TYR共存时也不影响TYR的信号，凸显了其基于酶催化机制的高特异性。

在黑色素瘤小鼠模型中的应用

为验证传感器的实际应用价值，研究在B16/F10黑色素瘤荷瘤小鼠模型中进行。随着肿瘤体积的增大（从68 ± 5.25 mm³增长到1280 ± 89.22 mm³），传感器检测到的小鼠血清中TYR浓度也相应升高（从0.084 ± 0.009 U/L增加到0.653 ± 0.028 U/L），两者呈显著正相关0.05).">。此外，传感器检测结果与商用TYR ELISA试剂盒的检测值呈现强线性相关（R²= 0.9926）。作为对照，在非黑色素瘤的4T1肿瘤模型中，即使肿瘤体积达到相近水平，血清TYR信号也与健康基线无显著差异，证实了该传感器对黑色素瘤的特异性识别能力，而非对所有肿瘤负荷的系统性反应。

讨论

本研究成功设计并构建了一种基于MWCNTs-tyr/Au/PEDOT纳米复合材料的电化学生物传感器。其核心在于巧妙地将TYR的特异性底物——酪胺，共价锚定在具有优异导电性的碳纳米管-金纳米颗粒复合网络上，再通过导电聚合物PEDOT稳定固定于电极界面。这种“三位一体”的设计实现了从生物识别到信号放大的高效协同。FTIR、TEM、UV-Vis等一系列表征手段确证了材料的功能化与复合成功。CV和EIS分析则从电化学角度揭示了修饰层对电极界面电荷转移的显著增强作用。

传感器的分析性能卓越，其宽线性范围覆盖了黑色素瘤患者血清TYR的病理浓度区间，而0.0091 U/L的极低检测限则使其能够捕捉到疾病早期微弱的生物标志物信号。基于酶催化转化机制的高特异性，使其能够有效抵御复杂血清基质的干扰。在动物模型中的成功应用，将优异的体外分析性能转化为了有价值的生物学洞察，明确了血清TYR作为黑色素瘤进展动态监测指标的可行性。

需要指出的是，在高浓度TYR（0.9 U/L）下进行多次测量后，传感器信号会出现衰减，这归因于酚羟基位点的饱和与不可逆氧化。因此，该传感器被定义为一次性使用设备，以确保每次检测的最大准确性，而非可重复使用的探针。

结论

本研究成功制备了一种基于MWCNTs-tyr/Au/PEDOT纳米复合材料的一次性电化学生物传感器，用于酪氨酸酶（TYR）的高灵敏度检测。该传感器表现出卓越的分析性能，其0.0091 U/L的低检测限和0.05–0.9 U/L的宽线性范围，有效解决了传统检测方法灵敏度不足和抗干扰能力差的挑战。荷瘤小鼠模型中的体内实验验证了传感器的生物学适用性，揭示了血清TYR水平与肿瘤体积之间的显著正相关性（随着肿瘤进展，从0.084 U/L升高至0.653 U/L）。这些发现证实了该传感器在动物模型中进行分期鉴别的能力，并确立了其作为黑色素瘤早期筛查和纵向监测的有前景的临床前工具。未来的工作将集中于在人类临床队列中验证该平台，以进一步评估其转化潜力。