《International Journal of Nanomedicine》：Engineered Exosomes Co-Delivering EGF and FGF Ameliorate Androgenetic Alopecia in a Mouse Model
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这篇研究通过基因工程技术构建了共载表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）的工程化外泌体（EXO-EGF/FGF），靶向递送并协同作用，有效逆转了雄激素性脱发（AGA）小鼠模型的毛囊萎缩和生长因子缺乏，为临床转化提供了安全高效的新策略。
引言
雄激素性脱发（AGA）是全球范围内最常见的脱发形式，其病理特征表现为毛囊微型化和毛发周期紊乱。现有的一线临床治疗方法，如米诺地尔和非那雄胺，存在经皮效率低、停药后易复发、可能引起性功能相关副作用以及无法逆转已萎缩的毛囊结构等显著局限性。研究表明，AGA患者毛囊中关键生长因子的表达下调，特别是表皮生长因子（EGF）和成纤维生长因子（FGF），它们是调控毛囊再生、维持毛囊干细胞多能性及驱动细胞周期进展的关键调节因子。然而，外源性游离EGF/FGF的局部应用面临角质层物理屏障、头皮微环境中蛋白酶降解以及缺乏靶向性等挑战，导致疗效有限且难以维持有效的局部治疗浓度。
外泌体作为一种天然的细胞间通讯纳米信使，因其固有的载药能力、低免疫原性和微环境调节特性而成为再生医学的研究焦点。然而，天然外泌体内源性生长因子含量低，不足以持续激活再生通路，且缺乏对毛囊的特异性靶向。为了克服这些缺陷，本研究采用了溶酶体相关膜蛋白2B（LAMP2B）融合工程技术，构建了能够过表达EGF和FGF的工程化外泌体（EXO-EGF/FGF），旨在实现生长因子向毛囊的高效、稳定和靶向递送，从而修复AGA的病理微环境。
材料与方法
本研究首先通过临床样本分析，验证了AGA患者毛囊中生长因子的表达谱。利用LAMP2B融合工程技术，以293T细胞为供体细胞，成功构建了负载EGF和FGF的双因子工程化外泌体（EXO-EGF/FGF）。通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）对EXO-EGF/FGF进行了表征。在体外实验中，评估了EXO-EGF/FGF对人真皮乳头细胞（HDPCs）增殖和迁移的调节作用。此外，研究还建立了雄激素诱导的AGA小鼠模型，以在体内评估EXO-EGF/FGF的治疗效果和安全性，具体包括毛发覆盖密度、毛囊结构完整性、生长相毛囊数量以及免疫原性和全身毒性的检测。
结果
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AGA患者毛囊存在EGF/FGF表达缺陷
对AGA患者和健康对照（HC）头皮组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析显示，AGA毛囊的毛髓质、皮质和内根鞘细胞中，与毛囊再生相关的NOTCH信号通路蛋白表达显著下调。鉴于NOTCH通路是EGF/FGF的关键下游效应器，这一结果提示AGA毛囊可能存在EGF/FGF表达障碍。随后的免疫荧光共定位、Western印迹和免疫组化分析均证实，与HC相比，AGA患者毛囊（尤其是真皮乳头和外根鞘区域）的EGF和FGF蛋白水平显著降低。
- 2.
EXO-EGF/FGF的成功构建与表征
研究成功构建了表达EGF-FGF-LAMP2B融合蛋白的工程化外泌体。透射电镜结果显示EXO-EGF/FGF呈现出典型的杯状双膜囊泡结构。纳米颗粒追踪分析表明其粒径分布均匀，峰值直径约为98 nm。SDS-PAGE和Western印迹分析进一步确认了EXO-EGF/FGF中EGF和FGF融合蛋白的成功装载，且表达水平显著高于天然外泌体。细胞毒性试验表明，EXO-EGF/FGF在测试浓度范围内无细胞毒性，并能促进HDPCs的活力。
- 3.
EXO-EGF/FGF在体外促进毛囊再生
在二氢睾酮（DHT）诱导的AGA细胞模型中，EXO-EGF/FGF处理能显著促进人真皮乳头细胞（HDPCs）的增殖和迁移。流式细胞术分析显示，EXO-EGF/FGF干预诱导了HDPCs细胞周期的重分布，使处于G0/G1期的细胞比例下降，而S期细胞比例增加，表明其通过促进G1/S期转换来驱动细胞增殖。Ki67免疫荧光染色证实了EXO-EGF/FGF对HDPCs增殖的增强作用。划痕实验结果表明，EXO-EGF/FGF处理显著提高了AGA模型HDPCs的伤口闭合率，证明其能有效促进细胞迁移。
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EXO-EGF/FGF在AGA动物模型中促进毛发再生
在雄激素诱导的AGA小鼠模型中，局部皮下注射EXO-EGF/FGF能有效促进毛发再生。宏观观察显示，治疗组小鼠的毛发覆盖密度得到显著恢复。组织学分析（H&E染色）表明，EXO-EGF/FGF处理能逆转微型化的休止期毛囊，使其转变为生长期毛囊，并伴有特征性的形态学恢复。免疫组化结果进一步证实，EXO-EGF/FGF能显著上调皮肤毛囊中Ki67、EGF和FGF的表达水平。
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EXO-EGF/FGF展现出良好的体内安全性
对治疗后的小鼠进行系统的生物安全性评估。主要器官（肝、肾、心、肺、脾）的宏观观察和组织病理学评估（H&E染色）未发现病理学病变，如坏死、炎症浸润或纤维化改变。全血细胞计数分析以及肝肾功能生物标志物（ALT、AST、BUN、肌酐）检测均表明所有参数维持在正常生理范围内，证明了EXO-EGF/FGF具有良好的生物安全性。
讨论
本研究通过整合单细胞转录组学和蛋白质组学分析，明确了AGA进展的核心机制之一——毛囊微环境中生长因子的缺乏，这为通过补充EGF/FGF来调节毛囊微环境的治疗策略提供了理论依据。与传统的生长因子疗法相比，本研究采用的工程化外泌体策略具有明显优势。通过LAMP2B融合表达技术，EGF/FGF被精确锚定在外泌体膜上，有效避免了游离因子在组织间质中被蛋白酶降解的问题，并实现了向靶细胞的高效递送。
工程化外泌体EXO-EGF/FGF通过双重作用促进毛发再生：一是通过重启AGA毛囊的生长周期，促进HDPCs从静止期（G0/G1）向增殖期（S期）转换；二是通过增强生长期起始阶段HDPCs的迁移能力，促进关键的毛乳头-上皮细胞相互作用。在动物模型中的疗效验证表明，EXO-EGF/FGF能显著提高脱发区域的毛发覆盖率，并逆转毛囊微型化。
值得注意的是，将临床前发现转化为临床实践时，需考虑小鼠模型与人类AGA患者在治疗时机和疾病进展上的差异。长期AGA涉及的病理改变更为复杂，如毛囊周围纤维化等，这可能影响生长因子疗法的疗效。因此，EXO-EGF/FGF可能对早期AGA患者更有效，而对于长期AGA，可能需要联合抗纤维化或抗炎治疗。
为进一步优化该治疗平台，未来可探索两个方向：一是使用间充质基质细胞等替代细胞来源，利用其天然分泌的免疫调节因子和促血管生成因子，以同时中和AGA毛囊微环境中的炎症信号并刺激毛囊周围血管重建；二是进行剂型创新，开发微针贴片以取代传统的皮下注射，从而实现无痛自我给药并显著提高生物利用度。
结论
本研究开发并验证了一种基于LAMP2B膜锚定技术的工程化外泌体策略EXO-EGF/FGF，用于治疗雄激素性脱发。该策略通过实现EGF和FGF向毛囊微环境的高效、持续递送，有效克服了传统生长因子疗法稳定性差和缺乏靶向性的关键局限。结果表明，EXO-EGF/FGF能通过刺激人真皮乳头细胞的增殖和迁移，有效重启毛发再生周期。在雄激素诱导的AGA动物模型中，该治疗显著逆转了毛囊微型化并增加了毛发覆盖率。此外，EXO-EGF/FGF展现出优异的生物相容性和安全性，未检测到免疫原性。本研究为功能性毛发再生提供了一种新颖、有效且安全的治疗策略，具有显著的临床转化前景。
