《International Journal of Nanomedicine》：Macrophage-Derived CuET Vesicles Synergistically Enhance Paclitaxel Efficacy by Inhibiting Tumor Growth and Boosting Immunity in Breast Cancer
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本文报道了一种创新性纳米治疗策略：利用巨噬细胞来源的细胞外囊泡(MEVs)装载铜死亡诱导剂CuET，构建MEVs@CuET靶向递送系统。该研究揭示，MEVs@CuET不仅能通过靶向递送CuET诱导乳腺癌细胞发生铜死亡，更与一线化疗药紫杉醇(PTX)产生显著的协同抗肿瘤效应。深入的机制研究表明，联合疗法能显著上调IL-17信号通路，激活以Th17细胞为主导的抗肿瘤免疫反应。此项工作为克服乳腺癌（尤其是三阴性乳腺癌）对紫杉醇的耐药性提供了一条融合“靶向递送-新型死亡方式-免疫激活”的创新治疗思路，具有重要的转化医学价值。
引言
乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的恶性肿瘤之一，尽管靶向治疗和免疫治疗（如HER2靶向药物和免疫检查点抑制剂）取得了进展，但以紫杉醇(PTX)为基础的化疗仍是治疗的基石。然而，其临床应用常因耐药性和剂量限制性毒性而受限，这在缺乏有效靶点的三阴性乳腺癌中尤为突出。因此，开发能增强紫杉醇敏感性和疗效的新型联合策略至关重要。
铜死亡是一种新近发现的铜依赖性细胞死亡形式，因其对线粒体丰富的癌细胞具有潜在选择性杀伤作用而受到关注。此外，铜死亡可作为一种强效的免疫原性细胞死亡触发因素，释放损伤相关分子模式，激活适应性免疫反应。但如何实现铜基化合物的靶向递送以在提高疗效的同时降低全身毒性，是其临床转化的主要障碍。
细胞仿生药物递送平台，特别是细胞外囊泡，为解决这一挑战提供了可能。其中，巨噬细胞来源的细胞外囊泡(MEVs)因其固有的生物相容性、长循环时间和天然靶向炎症及肿瘤部位的能力而备受关注。本研究的核心是设计一种基于巨噬细胞来源的细胞外囊泡装载铜死亡诱导剂CuET(MEVs@CuET)的治疗策略，旨在靶向递送CuET，诱导铜死亡，并与紫杉醇联合，评估其协同抗肿瘤效果及其免疫调控机制。
材料与方法
研究团队通过冻融法和超声处理从RAW264.7细胞中提取并制备了MEVs。利用超声孵育结合膜挤压法制备了尺寸分布均匀的MEVs@CuET，并以红细胞膜囊泡(REVs@CuET)作为对照。表征结果显示，MEVs@CuET的Zeta电位为-26.14 ± 0.60 mV，中值粒径为197.60 ± 1.11 nm，透射电镜证实其具有典型的囊泡结构。该制剂的包封率为78.2 ± 4.1%，载药量为6.8 ± 0.3%，并在7天的体外共培养实验中表现出优异的稳定性。
在细胞实验中，通过CCK-8法评估了药物的细胞毒性、IC50值及协同作用。使用细胞膜探针DiI构建MEVs@DiI和REVs@DiI进行细胞摄取分析。通过活/死细胞染色（Calcein-AM/PI）和流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）评估细胞凋亡。对经不同处理的4T1细胞进行转录组测序，并利用GO、KEGG和Reactome数据库进行通路富集分析。此外，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术检测了IL-17水平和Th17细胞。
在小鼠体内实验中，建立了原位4T1乳腺癌模型。通过尾静脉注射近红外探针IR 780标记的纳米粒进行体内分布研究。将荷瘤小鼠随机分为PBS组、紫杉醇单药组、MEVs@CuET单药组及紫杉醇与MEVs@CuET联合治疗组，评估肿瘤生长抑制、组织病理学（H&E染色、Ki-67、Bcl-2、TUNEL染色）以及免疫指标（CD3+CD4+T细胞浸润、血清IL-17水平、脾脏Th17细胞含量）的变化。同时，监测了小鼠的体重和血常规、生化指标以评估安全性。
结果与讨论
1. MEVs@CuET的构建、表征及其靶向性
研究成功制备了MEVs@CuET。考马斯亮蓝染色和Western blot（CD14蛋白）证实了所提取MEVs的膜蛋白结构完整性和特异性膜蛋白富集。细胞摄取实验表明，MEVs@DiI在4T1细胞中的摄取呈现时间依赖性，且在各个时间点均比REVs@DiI对照组显示出更强的荧光信号，表明MEVs具有高效靶向乳腺癌细胞的能力。
2. MEVs@CuET与紫杉醇的体外协同抗肿瘤作用
CCK-8实验确定了紫杉醇、CuET、MEVs@CuET和REVs@CuET对4T1细胞的IC50值分别为0.39 μg/mL、0.76 μg/mL、0.37 μg/mL和0.69 μg/mL，表明MEVs递送系统增强了CuET的肿瘤杀伤效力，且对正常成纤维细胞NIH/3T3显示出良好的生物安全性。利用SynergyFinder 3.0的ZIP模型分析显示，MEVs@CuET与紫杉醇联合使用的协同评分为29.37，并在较高浓度区域表现出更强的协同效应（最高区域协同评分达41.73）。活/死细胞染色和流式细胞术凋亡检测进一步证实，与单药治疗相比，联合治疗能显著导致更多4T1细胞死亡，并诱导更高比例的细胞凋亡（联合组凋亡率为54.33 ± 0.87%，显著高于单药组）。
3. 转录组学与功能分析揭示联合治疗的免疫相关机制
对4T1细胞的转录组测序分析发现，与紫杉醇单药组相比，联合治疗组存在1003个差异表达基因(DEGs)。KEGG富集分析显示，这些基因显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用和IL-17信号通路等免疫相关通路。体外验证实验表明，与药物处理的4T1细胞条件培养基共培养后，联合治疗组能显著促进小鼠脾脏淋巴细胞分泌更高水平的IL-17，并诱导更高比例的Th17细胞。这些结果提示，MEVs@CuET可能通过调节IL-17信号通路来增强紫杉醇的抗肿瘤作用。
4. MEVs@CuET的体内分布与抗肿瘤疗效
体内分布研究表明，尾静脉注射后，MEVs@CuET/IR 780在2小时即在肿瘤部位显著积累，荧光强度随时间延长而增加，24小时达到最高。相比之下，REVs@CuET/IR 780的肿瘤积累延迟且较弱。在原位4T1乳腺癌模型中，联合治疗展现出最强的肿瘤生长抑制效果，第28天的平均肿瘤抑制率达到91.47%，显著优于单药治疗组（紫杉醇单药39.79%，MEVs@CuET单药45.74%）。组织学分析显示，联合治疗组肿瘤细胞密度降低，出现凋亡和坏死特征；Ki-67阳性细胞比例和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降，TUNEL阳性细胞比例大幅增加。
5. 联合治疗的免疫激活效应
与体外结果一致，体内实验证实联合治疗能显著上调抗肿瘤免疫反应。联合治疗组小鼠肿瘤组织中CD3+CD4+T细胞浸润数量是紫杉醇单药组的1.84倍。同时，小鼠外周血血清中IL-17浓度以及脾脏淋巴细胞中Th17细胞的比例也显著高于单药治疗组和PBS对照组。
6. 体内安全性评估
安全性评估显示，所有治疗组（包括联合治疗组）小鼠的主要血细胞系（红细胞、白细胞、血小板）数量均无显著降低，肝肾功能（ALT、AST、尿素、肌酐）及心肌损伤标志物（CK-MB）均未见明显异常。联合治疗组小鼠体重在整个研究期间未出现显著下降，后期甚至略有增加。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色也未发现明显的病理学改变，表明该联合治疗方案具有较高的体内安全性。
结论
本研究证实，巨噬细胞来源的细胞外囊泡(MEVs)可作为递送铜死亡诱导剂CuET的有效纳米载体，构建的MEVs@CuET系统具有良好的肿瘤靶向性和稳定性。MEVs@CuET与紫杉醇的联合应用，不仅通过诱导铜死亡和促进凋亡对乳腺癌细胞产生直接的协同杀伤作用，更能显著激活以IL-17信号通路和Th17细胞为核心的抗肿瘤免疫反应，从而在体内外模型中均表现出卓越的抗肿瘤功效，且安全性良好。这项工作为克服乳腺癌（特别是三阴性乳腺癌）的紫杉醇耐药性提供了一种融合“靶向递送-新型细胞死亡-免疫激活”的创新性联合治疗策略，具有重要的潜在临床应用价值。
